Trombin ve lizozimin özgün aptamer kullanılarak zenginleştirilmeleri ve kütle spektrometresi ile tayinleri
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2012
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ÜLKÜ GÜLER
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): BEKİR SALİH
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Aptamerler, çok farklı özelliklerde sentezlenebilen, hedef moleküle yüksek seçicilikle bağlanan, deoksiribonükleik asit (DNA) ve ribonükleik asit (RNA) oligonükleotitleridir. Aptamerler, hedef moleküllerin (peptitler, proteinler, fosfolipitler, karbonhidratlar, nükleik asitler, ilaçlar, boyalar, enzimler ve aminoasitler gibi) üç boyutlu yapılarını yüksek afinite ve seçicilik ile tanıyabilmektedir. Aptamerler, afinite ve duyarlılıkları bakımından antikorlara alternatif adaylardır. Protein-antiprotein etkileşimleri protein-aptamer etkileşimlerine göre daha zayıftır. Protein- aptamer kompleksleri için ayrışma denge sabitinin (Kds) değeri 10-9-10-12 M aralığındadır.Aptamerlerin yukarıda bahsedilen uygun olan özelliklerinden dolayı, tez kapsamında yapılan çalışmalarda, kan serumunda düşük miktarlarda bulunan lizozim enziminin ve trombin proteinin aptamer bağlı polimerik yüzeylerde yüksek seçicilikle zenginleştirilmesi amaçlanmıştır. İlk olarak, Matriks Yardımlı Lazer Desorpsiyon/İyonlaştırmalı Kütle Spektrometresi (MALDI-Kütle Spektrometresi) ile yapılacak analizlerde kullanılacak en uygun matriksin tespit edilmesi çalışmaları lizozim enzimi, lizozim aptameri ve lizozim enzimi-aptamer kompleksleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Analizler için uygun olan matriksler tespit edildikten sonra, lizozim enzimi zenginleştirilmesinde kullanmak amacıyla, amin fonksiyonel gruplu polistiren divinil benzen (PS-DVB) polimerik yüzeylerine Sülfo-Süksinimidil-4-(N-maleimidometil) siklohekzan-1- karboksilat (Sulfo-SMCC) çapraz bağlayıcısı aracılığıyla, 5' ucunda -SH fonksiyonel grubu bulunan lizozim aptamerinin kovalent olarak bağlanmasıyla aptamer bağlı yüzeyler elde edilmiştir. Lizozim enzimiyle muamele edilen yüzeyler üzerinde tripsin enzimi ile parçalama işlemi gerçekleştirildikten sonra elde edilen ürünler, MALDI-Kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Alınan sonuçlar değerlendirildiğinde, 0.07 pmol/µL gibi çok düşük lizozim enzimi derişimine sahip örnek içerisinden lizozim enziminin başarıyla zenginleştirilebildiği görülmüştür. Ayrıca, farklı proteinlerin de içerisinde bulunduğu karmaşık örnek çözeltileri kullanılarak MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan zenginleştirme çalışmalarında geliştirilen malzeme ve yöntem kullanılarak lizozim enziminin yüksek seçicilikle zenginleştirildiği gözlenmiştir. Trombin proteininin zenginleştirme çalışmaları da aynı yöntem kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Trombin proteini zenginleştirmesi için kullanılan amin fonksiyonel gruplu PS-DVB polimerik yüzeylere de Sulfo-SMCC çapraz bağlayıcısı aracılığıyla, 5' ucunda SH fonksiyonel grubu bulunan trombin aptameri kovalent olarak bağlanarak aptamer bağlı yüzeyler elde edilmiştir. Trombin proteini ile muamele edilen yüzeyler üzerinde tripsin enzimi ile parçalama işlemi gerçekleştirildikten sonra elde edilen peptit türleri, MALDI-Kütle spektrometresi ile analiz edilmiştir. Alınan sonuçlara göre, 0.0007 pmol/µL derişimdeki trombin, bulunduğu örnek içerisinden başarıyla zenginleştirilmiştir. Ayrıca, farklı proteinlerin de içerisinde bulunduğu karmaşık örnek çözeltileriyle yapılan zenginleştirmelerde, MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan analizler sonucunda, lizozim enzimine ait peptit fragment kütlelerinin sinyalleri, seçiciliğin yüksek olduğunu göstermiştir. Son olarak, doğal örnek olarak kullanılan kan plazmasından trombin proteininin zenginleştirilmesi çalışmaları yapılmıştır. MALDI-Kütle spektrometresi ile yapılan analiz sonuçlarına göre, tez kapsamında geliştirilen malzeme ve yöntem kullanılarak trombin proteininin kan serumundan yüksek seçicilikle zenginleştirilebildiği gözlenmiştir.