Aort onarımı için deselülerize ve hibrit matrikslerin geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SELCAN GÜLER
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): HALİL MURAT AYDIN
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sunulan tez çalışmasının amacı kardiyovasküler sistemin sert hemodinamik çevresinde dayanımı yüksek, gelişebilen, bağışıklık sistemi tarafından reddedilmeyen hücresizleştirilmiş (deselülerize/aselüler) doğal kaynaklı aort damar greftlerinin elde edilmesidir. Bu doğrultuda insan aort dokusuna yapısal ve işlevsel olarak benzerliğiyle öne çıkan koyun ve domuz aortu uygun model olarak belirlenmiştir. Tez çalışması kapsamında hem fiziksel ve hem kimyasal iki ayrı deselülerizasyon protokolü geliştirilmiş ve son aşamada deselülerize edilmiş aort grefti PGS (Poli(gliserol-sebakat)) elastomeri ile kombine edilerek esnekliği ve dayanımı arttırılmış hibrit aort grefti elde edilmiştir. Tezin ilk aşamasında süperkritik karbondioksit (sc-CO2) ekstraksiyonuna dayanan fiziksel deselülerizasyon yöntemi uygulanarak intakt tübüler formdaki koyun aort greftleri 37 °C'de iki ayrı basınç noktasında hücresizleştirilmiştir ve ardından histolojik ve taramalı elektron mikroskop (SEM) analizleri yapılarak karakterizasyon testleri gerçekleştirilmiştir. Her iki ayrı basınç değerinde de sc-CO2 uygulamasıyla hücrelerin dokudan uzaklaştırıldığı gözlenmiştir. Tezin ikinci aşamasında kimyasal deselülerizasyon protokollerinin geliştirilmesi için SDS tabanlı bir protokol oluşturularak domuz aort grefti 3 saat içerisinde deselülerize edilmiştir. Kimyasal deselülerizasyon protokolünün optimizasyonu sürecinde protokolde kullanılan temel deselülerizasyon ajanına maruz kalma süresinin, karıştırıcı hızının, işlem sonrası yıkama süresinin ve protokole ilave edilen DMSO‟nun (dimetil sülfoksit) deselülerizasyon işlemi üzerine etkisi değerlendirilmiştir. Deselülerizasyon başarısının tespiti için hematoksilen ve eozin (HE), artık nükleusların tepiti için DAPI, doku iskelesindeki kolajen miktarının belirlenmesi için PicroSirius Red ve son olarak doku iskelesindeki elastik fiber ve kolajen tayini için Verhoff-Van Gieson boyamalarıyla histolojik analizler gerçekleştirilmiştir. Deselülerizasyon işlemi sonrası dokuda kalan artık DNA miktarının sayısal olarak belirlenmesi için PicoGreen testi, dokuda kalan glikozaminoglikan miktarının sayısal olarak belirlenmesi için dimetil metilen mavisi testi (DMMB) yapılarak biyokimyasal analizler gerçekleştirilmiştir. PicoGreen testi sonucu geliştirilen protokol ile domuz aort greftinin %99.08 hücresizleştirildiği belirlenmiştir. Ayrıca deselülerizasyon işleminin dokunun yaş ağırlık ve kalınlığı üzerine etkisi belirlenmiştir. Deselülerizasyon işleminin doku iskelesinde oluşturduğu etkiler SEM analizi yapılarak da değerlendirilmiş ve geliştirilen protokol ile yapının korunduğu gözlenmiştir. Yapılan bütün analizler ile etkinliği belirlenen en iyi deselülerizayon protokolüyle üretilen aort greftinin sitotoksik etkisi kalp kapakçığından izole ettiğimiz VIC (Valvular Interstitial Cells) hücreleriyle Canlı/Ölü testi ve Alamar mavisi hücre aktivite testi yapılarak değerlendirilmiş ve herhangi bir sitotoksik etki gözlenmemiştir. Geliştirilen deselülerizasyon protokolü ile elde edilen aselüler damar grefti yeniden hücrelendirilerek (reselülerizasyon) konfokal mikroskopisiyle görüntülenmiştir. Tezin son aşamasında deselülerize edilmiş aort grefti Poli(gliserol-sebakat) (PGS) elastomeri ile kombine edilerek esnekliği ve dayanımı arttırılmış hibrit aort grefti elde edilmiştir. Bu doğrultuda mikrodalga prepolimerizasyonunu takiben 150 C sıcaklık ve 50 mbar‟lık vakum altında çapraz bağlama suretiyle sentezlenen PGS elastomerinin karakterizasyonu gerçekleştirilmiştir. Bu amaçla yapının çapraz bağlanma karakteri Hidrojen Nükleer Manyetik Rezonans (1H-NMR) ve Fourier Transform Kızılötesi Spektroskopisi (FTIR) ile incelenmiştir. Termal özellikler ise Diferansiyel Taramalı Kalorimetre (DSC) ile gözlenmiştir. Aselüler damar grefti prepolimerize PGS‟ye tamamen gömülerek 10 saat boyunca 50 mbar ve 150 °C‟de çapraz bağlanmaya maruz bırakılmıştır. Elde edilen PGS-aselüler aort hibrit damar greftinin mekanik çekme testi ile aselüler grefte göre esnekliğinin arttığı görülmüştür. Histolojik analiz, SEM analizi ile yapısal olarak değerlendirilmiştir. İnsan abdominal aort düz kas hücreleri ile gerçekleştirilen hücre kültür çalışmalarında Canlı/Ölü testi ve Alamar mavisi hücre metabolik aktivite testi yapılmış ve sitototoksik etkiye rastlanmamıştır. PGS-aselüler aort hibrit grefti reselülerize edilerek konfokal mikrokopisi ve SEM analiziyle değerlendirilmiştir. Anahtar Kelimeler: Aort, Deselülerizasyon, sc-CO2 (süperkritik karbondioksit), SDS (sodyum dodesil sülfat), DMSO (dimetil sülfoksit), PGS (Poli(gliserol-sebakat)), Reselülerizasyon.