Süne zararının tespiti için florometrik yöntem geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: BEGÜM ZEYNEP HANÇERLİOĞULLARI
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): FAHRİYE CEYDA DUDAK ŞEKER
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Ülkemizde buğdayın teknolojik özelliklerini olumsuz yönde etkileyen hububat zararlıların başında Süne (Eurygaster spp.) gelmektedir. Bu zararlıların buğday tanesine bıraktıkları sindirim salgıları, özellikle içerdiği proteolitik enzimler, gluten proteinlerinin parçalanmasına neden olarak ekmeklik kalitesini düşürmektedir. Bu nedenle ürüne işlenecek unlarda süne zararının tespit edilmesi büyük önem taşımaktadır. Süne zararının belirlenebilmesi için yaygın olarak kullanılan yöntemler uzun zaman almakta ve uzman personele ihtiyaç duymaktadır. Bu nedenle, buğdayın süne zararı görüp görmediğinin hızlı, kolay ve yerinde kantitatif tayini büyük önem taşımaktadır. Yapılan bu çalışmada, süne proteazına yönelik, enzimin etki ettiği yüksek molekül ağırlıklı glutenin altbirimlerinin tekrarlanan dizilimleri kullanılarak, peptit yapısında substrat geliştirilmesi ve substratın florometrik analiz sisteminde denenmesi amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda, öncelikle un örneklerinden süne proteazı ekstrakte edilmiş ve proteaz aktivitesinin maksimum olduğu ekstraksiyon koşulları belirlenmiştir. Süne proteazı-peptit etkileşimlerinin daha ayrıntılı bir şekilde incelenebilmesi için elde edilen ekstrakttan süne proteazı kısmi olarak saflaştırılmıştır. Daha sonra, peptit-süne proteazı etkileşimi için optimum koşullar belirlenmiştir. Süne proteazının yüksek oranda etki ettiği peptit dizilimi olan 15 amino asit uzunluğundaki PGQGQQGYYPTSPQQ potansiyel substrat olarak seçilmiştir. Seçilen bu peptit dizilimi FRET donor/alıcı çiftiyle işaretlenmiştir. Süne proteazının kantitatif tayini için substrat ve süne zararı görmüş undan elde edilen ekstrakt çözeltisi reaksiyon için belirlenen optimum pH ve sıcaklık değerlerinde karıştırılmıştır. Substratın zamana karşı floresans şiddetindeki artış floresans spektrofotometre ile ölçülmüştür. Enzim aktivite değerleri ise reaksiyon ilk hızlarından yola çıkılarak birim zamanda floresans şiddetindeki artıştan hesaplanmış ve reaksiyon hızlarının ekstrakt çözeltisinde artan proteaz konsantrasyonu ile artış gösterdiği saptanmıştır. Geliştirilen analiz yönteminin performans parametrelerinin belirlenmesinde, ilk olarak farklı Zeleny/modifiye Zeleny fark değerlerine sahip unlardan elde edilen ekstraktlarda enzim aktivite değerleri hesaplanmıştır. Daha sonra, Zeleny fark değerlerine karşılık aktivite değerleri grafiğe geçirilerek kalibrasyon grafiği elde edilmiştir. Bu florometrik analiz yönteminin -16 ile 2 mL Zeleny fark değeri aralığında doğrusal sonuç verdiği ve bu aralıkta hassasiyetinin 0.14 mL olduğu saptanmıştır. Florojenik substrat ile geliştirilen analiz yönteminin alt tespit limiti ise -2.71 mL Zeleny fark değeri olarak belirlenmiştir. Ayrıca, geliştirilen analiz yönteminin doğruluğunun belirlenebilmesi için süne zararı görmüş farklı bir un örneği incelenmiştir. Un örneğinden elde edilen reaksiyon hızı ile kalibrasyon grafiği kullanılarak Zeleny fark değeri belirlenmiş ve un örneğine ait deneysel olarak elde edilen değer ile karşılaştırılmıştır. Belirlenen bu iki Zeleny fark değeri karşılaştırıldığında hata oranı % 3.1 olarak bulunmuştur. Çalışmanın sonucunda, geliştirilen yöntemin analiz süresinin, örnek hazırlama süresi 70 dakika ve floresans ölçüm süresi 10 dakika olmak üzere, toplam 80 dakika olduğu saptanmıştır. Elde edilen sonuçlar doğrultusunda, seçilen florojenik peptit diziliminin süne proteazı aktivitesinin tespiti için önemli bir substrat adayı olduğu belirlenmiştir. Belirlenen peptit substrat ile unlarda süne zararının tespiti için hızlı ve kolay bir analiz metodu geliştirilmiştir.