Diabetes insipidus tanılı hastaların AVP-NPII geninde tanımlanan mutasyonların fonksiyonel analizleri
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MERVE ÖZCAN TÜRKMEN
Danışman: Hatice Mergen
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sağlıklı bireylerde kan ozmolalitesi, vücut su dengesini ayarlayan mekanizmalar aracılığıyla belirli sınırlar içerisinde tutulmaktadır. Plazma ozmolalitesindeki artış veya kan hacmindeki azalma ile böbreklere suyu koruması için sinyal gönderilerek susuzluk uyarılmaktadır. Bu uyarılma sonucu, arka hipofizde depolanmakta olan arjinin vazopressin hormonu (AVP, ADH, antidiüretik hormon) kana salınmaktadır. AVP hormonu, kan dolaşımı yoluyla böbreklere gelerek toplama kanalı hücrelerindeki arjinin vazopressin reseptör 2 (AVPR2)'ye bağlanmaktadır. AVP'nin AVPR2'ye bağlanması, hücre içerisinde bulunan akuaporin 2 su kanal proteinlerinin (AQP2) fosforillenerek apikal membrana yerleşmelerini sağlamaktadır. AQP2 su kanalı aracılığıyla ihtiyaç duyulan suyun geri emilimi gerçekleşmekte ve böylece vücuttaki su dengesi tekrar kurulmaktadır. Bu mekanizma içerisinde oluşabilecek herhangi bir aksaklık vücudun su dengesinin bozulmasına ve poliüri, polidipsi ile karakterize olan Diabetes insipidus (DI) hastalığının gelişimine neden olmaktadır. DI, AVP hormonun yetersiz sentezi ve/veya salınımına bağlı olarak santral tip (CDI) veya böbreklerde AVP'ye karşı yetersiz cevap oluşmasına bağlı olarak nefrojenik tipte (NDI) olabilmektedir. CDI, kafa travmaları, beyin tümörleri, cerrahi operasyonlar veya çeşitli hastalıklar sonucu nörohipofiz bölgesinin hasarı nedeniyle sonradan meydana gelebileceği gibi, arjinin vazopressin-nörofizin II (AVP-NPII) geninde bulunan mutasyonlar nedeniyle kalıtsal olarak da oluşabilmektedir. AVP-NPII geni ile ilgili yapılan çalışmalarda, gendeki mutasyonlar nedeniyle öncül hormonun düzgün bir şekilde katlanması ve işlenmesinde başarısızlık olduğu bulunmuştur. Bunun sonucunda mutant proteinin endoplazmik retikulum (ER) içerisinde birikerek protein agregasyonları oluşturduğu ve diğer esansiyel proteinlerin düzenli işlenmesini engelleyerek magnoselüler sinir hücrelerinin ölümüne yol açtığı tespit edilmiştir. Bu tez çalışmasının amacı, DI tanısı konmuş hastaların AVP-NPII geninde tanımlanmış G45C, 207_209delGGC ve G88V mutasyonlarına ilişkin literatürde yer almayan fonksiyonel analizlerinin gerçekleştirilmesidir. Bu amaçla yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip AVP-NPII geni içeren ifade vektörü üzerinde ilgili mutasyonlar bölgeye yönelik mutagenez yöntemi kullanılarak oluşturulmuş ve vektörlerin Neuro2A hücrelerine geçici transfeksiyonu gerçekleştirilmiştir. Neuro2A hücreleri tarafından besiyerine salınan yabanıl tip ve mutant AVP miktarları radyoimmün analiz (RIA) ve enzim-bağlı immünosorbent analiz (ELISA) yöntemleri olmak üzere iki ayrı yöntem ile belirlenmiştir. Yabanıl tip ve mutant öncül hormonların hücre içi trafiklerindeki farklılıkları belirleyebilmek için floresan görüntüleme çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Ayrıca, AVP miktarının belirlenmesinde kullanılan RIA yönteminin gerçekleştirilmesi zor ve uzun süren bir yöntem olmasından dolayı, yerine alternatif bir yöntem olarak daha hızlı sonuç veren ve gerçekleştirilmesi kolay olan ELISA yönteminin kullanılabilirliği istatiksel bir analiz olan Bland-Altman yöntemi ile değerlendirilmiştir. Çalışmanın sonucunda G45C ve G88V mutant proteinlerin yabanıl tip AVP-NPII proteinine göre hücre kültürü ortamında önemli ölçüde azalmış miktarda bulunduğu ve hücrede ER içerisinde takılı kaldığı belirlenmiştir. Bununla birlikte, 207_209delGGC mutant proteinin ise, hücre kültürü ortamında yabanıl tip proteine yakın miktarda bulunduğu ve yabanıl tip ile benzer şekilde ER'de takılı kalmayarak hücre içi kompartmanlara dağıldığı gözlenmiştir. G45C ve G88V mutasyonlarının öncül hormonun düzgün katlanması, üç boyutlu yapısını kazanması, işlenmesi veya hücre içi trafiği gibi süreçlerde önemli etkilere sahip olduğu, 207_209delGGC mutasyonunun ise bu süreçlerde herhangi bir önemli etkiye sahip olmadığı sonucuna varılmıştır. Ayrıca AVP miktarının belirlenmesinde, ELISA yönteminin RIA yöntemi yerine alternatif bir yöntem olarak kullanılabilceği belirlenmiştir.