Biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlarla desteklenmiş doku iskeleleri ile mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasının incelenmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ANIL SERA ÇAKMAK
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sunulan tez çalışması kapsamında, farklı biyomalzemeler kullanılarak biyofiziksel ve biyokimyasal uyaranlar varlığında mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaca yönelik olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda, kitosan doku iskeleleri ile fotostimülasyon, ipek biyomalzemeler ile elektrostimülasyon çalışmaları yürütülmüştür. Fotostimülasyon çalışmalarında kullanılan kitosan doku iskeleleri, liyofilizasyon yöntemi ile üretilmiş ve yapısal özellikleri belirlenmiştir. Sıçandan izole edilen adipoz kökenli kök hücreler (AdMSC) TCPS (hücre kültür kabı) yüzeylerde ve kitosan doku iskelelerinde 28 gün boyunca kültüre edilmiştir. Fotostimülasyon çalışmaları 590-1395 nm dalga boyu aralığındaki ışıkları içeren plazma ark kaynağı kullanılarak yapılmış ve hücreler gün aşırı ışığa maruz bırakılmıştır. TCPS yüzeylerde uygulama mesafesi 10 cm, uygulama süresi 5 dk ve kitosan doku iskeleleri için uygulama mesafesi 10 cm, uygulama süresi 5 dk olarak belirlenmiştir. Işığın her iki koşulda da, kontrol grubu ile karşılaştırıldığında hücre proliferasyonunu arttırdığı belirlenmiştir. TCPS yüzeylerde, ışık varlığındaki hücrelerin farklılaşmış morfolojisi, floresan mikroskop görüntüleri ile ortaya koyulmuştur. Ayrıca, optik mikroskop görüntüleri ile fotostimülasyonun uygulanan hücrelerde, hücre canlılığının daha uzun süre korunduğu belirlenmiştir. SEM analizi sonucu, ışık ile muamele edilen kitosan doku iskelelerinde, kontrol grubuna göre, daha yoğun ve homojen bir hücre dağılımına rastlanmıştır. TCPS yüzeylerdeki matris mineralizasyonu Alkalin fosfataz-von Kossa (ALP-VK) boyamalar ile görüntülenmiş ve ışığın mineralize matris üretimini arttırdığı tespit edilmiştir. Kitosan iskeleler ile yapılan von Kossa boyamalarda da, ışık uygulanan doku iskelelerinin daha koyu boyandığı görülmüştür. Hücre farklılaşmasının moleküler düzeyde incelenmesi amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmıştır. TCPS yüzeylerde ışığın kollajen tip 1 (Col1a1) ekspresyonunu uyardığı belirlenmiş ancak alkalin fosfataz (Alp), runt-ilişkili transkripsiyon faktör (Runx2) ve osteopontin (Opn) ekspresyon seviyeleri arasında anlamlı bir fark bulunamamıştır. Kitosan doku iskelelerinde ise, belirtilen genler açısından, ışığın gen ekspresyonları seviyesinde bir etkisine rastlanmamıştır. Elektrostimülasyon çalışmalarında ipek filmler ve ipek doku iskeleleri kullanılarak, elektriksel alanın hem 2-boyutlu hem de 3-boyutlu sistemlerde, insan kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (hMSC) osteojenik farklılaşması üzerindeki etkileri incelenmiştir. Bu amaçla, öncelikle hMSC'lerin kemik iliğinden izolasyonu ve karakterizasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Literatür bilgileri ışığında hücreler üzerine alternatif akım (AC) kullanılmasına karar verilmiştir. İpek filmler ile yürütülen elektrostimülasyon çalışmalarında, platin tel içeren ipek filmler kullanılmıştır. Optimizasyon çalışmaları sonucunda, 2.5 mm elektrot mesafesi ve 60 kHz frekans kullanılmasına karar verilmiştir. Yapılan analizler sonucu düşük voltajın hücre farklılaşması (10 mV), yüksek voltajın (50, 100, 250 ve 500 mV) ise hücre proliferasyonu üzerinde etkisi olduğu belirlenmiştir. Ayrıca elektrostimülasyon çalışmaları, faklılaşma ve büyüme ortamı olmak üzere farklı koşullarda yürütülmüş, elektriksel alanın, büyüme ortamı varlığında hücre proliferasyonunu, farklılaşma ortamı varlığında hücre farklılaşmasını uyardığı tespit edilmiştir. 10 mV ile yapılan çalışmalarda, Alizarin red boyamaları, elektriksel alanın, hücrelerin erken mineralizasyonunu uyardığını göstermiştir. Kültürün ilerleyen günlerinde, kontrol grubuna göre, elektrik uygulanan gruplarda mineralizasyon önemli derecede artmıştır. SEM analizi ile hücre-malzeme etkileşimleri ve elektriksel alan varlığında oluşan mineralize nodüller gösterilmiştir. İpek doku iskeleleri ile yapılan çalışmalarda, kullanılan doku iskeleleri çözücü döküm-partikül uzaklaştırma yöntemi ile üretilmiştir. Üretilen doku iskeleleri, Petri kapları içerisinde, karbon elektrotlar arasına yerleştirilmiş ve kültür ortamı aracılığıyla elektriksel alan ile etkileşime girmeleri sağlanmıştır. 3-boyutlu sistemlerde yapılan elektrostimülasyon çalışmalarında, dışarıdan uygulanan elektriksel alan yanında, hücre içerisinde de elektriksel sinyaller oluşturmak hedeflenmiştir. Bu amaçla, hücre membranındaki iyon kanalları üzerinde etkisi olduğu bilinen, monensin ve glibenklamid adlı kimyasallar kullanılmış ve bu kimyasallar ile elektriksel alanın, osteojenik farklılaşma üzerindeki sinerjik etkisi incelenmiştir. İpek doku iskeleleri ile yapılan çalışmalarda, film çalışmalarında belirlenen 60 kHz frekans değeri olarak kullanılmıştır. Elektrotlar arası mesafe 8 mm ve optimizasyon çalışmaları doğrultusunda, voltaj 200 mV olarak seçilmiştir. 3-boyutlu sistemlerde, elektrostimülasyonun ve biyokimyasalların hücre proliferasyonu üzerinde etkisi gözlenmemiştir. Gruplar arasında karşılaştırılma yapıldığında, monensinin erken dönem osteojenik genler olan ALP ve RUNX2 ekspresyonlarını arttırdığı görülmüştür. Örneklerdeki ALP aktivitesi de bu sonucu desteklemektedir. Monensinin COL1A1, BSP ve OPN ekspresyonlarını ise inhibe ettiği görülmüş, elektriksel alan varlığında bu inhibisyonun ortadan kalktığı belirlenmiştir. Diğer yandan glibenklamidin, özellikle BSP ve OPN gibi geç dönem osteojenik genler üzerinde etkisi olduğu tespit edilmiş, örneklerdeki Ca içeriği de benzer sonuçları vermiştir. Glibenklamid, elektriksel alan ile birlikte hMSC'ler üzerinde sinerjik bir etki oluşturmuş ve osteojenik farklılaşmayı arttırmıştır. SEM analizi ile hücre morfolojisi incelenmiş, hücrelerin gözeneklerin iç kısmına yerleşerek, kollajen fiberler ve mineralize nodüller sentezledikleri belirlenmiştir. Tüm örnekler için, hemotoksilen&eozin boyamaları etkin bir hücre-malzeme etkileşimini işaret etmektedir. Alizarin red ve von Kossa boyamaları da RT-PCR sonuçlarını desteklemektedir. Elektriksel alan varlığında, glibenklamid ile muamele edilen örneklerde, çok daha büyük ve homojen bir mineralizasyona rastlanmıştır. Elde edilen veriler, mezenkimal kök hücrelerin metabolik aktivitelerinin düzenlenmesinde, fotostimülasyon ve elektrostimülasyon gibi biyofizksel uyaranların etkin bir rol oynadığını göstermektedir. Meydana gelen hücresel cevap, hücre tipine, mikroçevreye ve uygulama parametrelerine göre değişiklik göstermektedir. Hücre farklılaşmasında rol oynayan bir diğer faktör de biyokimyasal uyaranlardır. Bu amaçla kullanılan monensin ve glibenklamidin, elektrostimülasyon ile sinerjik bir etki oluşturduğu belirlenmiştir.