L-KARNİTİN YÜKLÜ POLİMERİK VE LİPİT BAZLI NANOPARTİKÜLER SİSTEMLERİN HAZIRLANMASI VE İN-VİTRO DEĞERLENDİRİLMESİ


Thesis Type: Doctorate

Institution Of The Thesis: Hacettepe University, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji Ve Nanotıp A.B.D., Turkey

Approval Date: 2019

Thesis Language: Turkish

Student: Merve Yaşacan

Consultant: İpek Eroğlu

Abstract:

L-karnitin, metabolizmada yağ yıkımını ve kas yapımını arttırıcı metabolik etkilerinden dolayı son yıllarda obezite, diyabet, bölgesel zayıflama gibi çağın önemli sorunlarının tedavisinde dikkat çekmektedir. Temel işlevi uzun zincirli yağ asitlerinin beta oksidasyona uğratılması için mitokondriye aktarılması olan L-karnitin, vücuda hem eksojen hem de endojen olarak iki kaynaktan sağlanmaktadır. Gıdalardan alınan L-karnitin'in en önemli kaynakları, kırmızı et ve süt ürünleridir. Gıda sektöründeki suni yemleme ve seri üretimin artışı, yiyeceklerle alınan L-karnitin’in vücuttaki miktarının yetersiz kalmasına sebep olmakta, buna bağlı olarak obezite oranları artmaktadır. Bu nedenle L-karnitin, sporcular ve kilo vermek isteyen kişiler tarafından sıklıkla takviye olarak alınmaktadır. Ancak, L-karnitin’in düşük biyoyararlanıma sahip olması (%14-18), vücutta depolanamaması ve yarılanma ömrünün kısa olması (30-60 dk) nedeniyle, etkin tedavi sağlanabilmesi için sık doz uygulama gerektirmektedir. Ayrıca, L-karnitin'in Avrupa ve Amerikan Farmakope Monograflarında tanımlı impüriteleri bulunmaktadır. Bu nedenle, içerisinde safsızlık varlığı bilinen L-karnitin'in yüksek miktarda ve sık aralıklarla uygulanması toksik ve yan etkileri arttıracağından, kontrollü salım sistemlerinin geliştirilmesi oldukça önem arz etmektedir. Kontrollü salım sistemleri olarak nanopartiküler ilaç taşıyıcı sistemlerin geleceği, nanopartikül yapısının ve hedefleme mekanizmasının aydınlatılmasının yanı sıra hücre üzerine etkilerinin metabolik düzeyde değerlendirilmesine bağlıdır. Nanolipozomlar; hücre membranına benzer lipit çift tabaka yapısında olup, etkin madde penetrasyonunu arttırma özelliğine sahiptirler. Polimerik nanopartiküller ise; kontrollü salım ve artırılmış stabilite özellikleri nedeniyle nanotaşıyıcı sistemler arasında en sık kullanılan etkin ve güvenilir sistemlerdir. 

 

Bu amaçla tez kapsamında; L-karnitin yüklü nanolipozom ve PLGA nanopartikül formülasyonları hazırlanmış, formülasyonların karakterizasyon (partikül boyutu (PB), polidispersite indeksi (PDI), zeta potansiyel (ZP), morfoloji (SEM), yüzde enkapsülasyon etkinliği (%EE), moleküler yapı/termal özellikler aydınlatma (FT-IR/ATR, TGA)) ve stabilite çalışmaları yapılmıştır. L-karnitin enkapsüle edilmiş nanolipozom (Lipo-karnitin) ve L-karnitin enkapsüle edilmiş PLGA nanopartikül (Nano-karnitin) formülasyonları için sırasıyla; PB değerleri 97.88±2.96 nm ve 250.90±6.15 nm; PDI değerleri 0.35±0.01 ve 0.22±0.03; ZP değerleri 6.36±0.54 mV ve -30.80±2.26 mV; %EE değerleri ise 14.26±3.52 ve 21.93±4.17 olarak bulunmuştur. Diyaliz membran yöntemiyle, Lipo-karnitin, Nano-karnitin formülasyonları ve L-karnitin'in aynı konsantrasyondaki serbest çözeltisiyle karşılaştırılmalı in-vitro salım çalışmaları yapılmıştır. Kontrol çözeltisi 1. saatin sonunda konsantrasyonun %90'ını ani salım ile sonlandırırken, hazırlanan her iki formülasyon için, 1. saatin sonunda gözlemlenen ani salım etkisinden (% 59.90 ve % 65.19)  sonra, 2, 4, 6, 8 ve 12.saat salım noktalarından, geciktirilmiş bir kontrollü salım profili elde edilmiştir. Salım profillerine kinetik modeller (sıfırıncı derece, birinci derece, Higuchi, Hixson Crowell) uygulanmış,  determinasyon katsayısı (r2)  değerlerinin sırasıyla 0.8539 ve 0.9167 bulunduğu ve her iki formülasyonun da “Birinci Derece” kinetik modele uyum sağladığı tespit edilmiştir. Salım çalışmalarını takiben, in-vitro koşullarda kardiyak fibroblast hücreleri üzerinde formülasyonların etkinliği metabolomik çalışmalar ve yolak analizleri ile değerlendirilmiştir. Kardiyak fibroblastlarda yüksek enerji ihtiyacından dolayı mitokondri sayısı fazladır. Dolayısıyla L-karnitin, enerjilerinin çoğunu yağ asidi oksidasyonundan türeten bu hücrelerin metabolizması için, kritik bir rol oynamaktadır. Hücre içi metabolizma bileşenleri olan metabolitlerin belirlenebildiği ve düzeylerinin anlık görüntüsünün alınabildiği metabolomik çalışmalardan elde edilen sonuçlar kıyaslanarak serbest L-karnitin'in ve L-karnitin yüklü nano-sistemlerin amino asit, karbonhidrat ve lipit metabolizmaları üzerindeki etkileri değerlendirilmiştir. L-karnitin’in salım süresinin uzatılmasıyla paralel olarak, Lipo-karnitin ve Nano-karnitin formülasyonlarının, amino asit, karbonhidrat ve lipit metabolizmaları üzerinde etkili oldukları saptanmıştır. Polar yan zincire sahip amino asit düzeylerinin artışında en etkili formülasyonun Nano-karnitin olduğu belirlenmiştir. Sitrik Asit (SA) döngüsüne ait sitrik asit, akonitik asit, süksinik asit, fumarik asit, malik asit, okzaloasetik asit düzeylerinde Nano-karnitin formülasyonu, kontrol ve Lipo-karnitin gruplarına kıyasla daha etkili bulunmuştur. Yeterli miktarda bulunduğunda glutamata dönüşen ve bu bileşik üzerinden ornitin, arjinin ve prolin aminoasit metabolik yolakları üzerinde etkili olan SA döngüsü arabileşeni α-ketoglutarat için ise, Lipo-karnitin normalize edilmiş pik alanı değerinde bütün gruplara göre anlamlı (p<0.05) bir düşüş (-1.321±0.20) gözlenmiştir. Doymuş yağ asitleri ve doymamış yağ asitleri üzerine etkileri ayrı ayrı incelendiğinde ise, Lipo-karnitin'in, serbest L-karnitine ve Nano-karnitine kıyasla daha etkili olduğu saptanmıştır. 

 

Sonuç olarak, uzun süreli etki ile L-karnitin'in yarılanma ömrünün uzatıldığı, sık kullanımın önlenmesine bağlı olarak yan etkilerinin azaltıldığı ve hasta uyuncunun arttırıldığı nano-sistemler hazırlanmış, serbest L-karnitin grubuna kıyasla daha etkili bir metabolomik profil değişikliği sağlanmıştır. Böylece hücrelerin ortamda aşırı bulunan maddeleri depolamak yerine, bu maddeleri metabolik işlevlerde etkin olarak kullanmalarını sağlayacak ve piyasada bulunan konvansiyonel preparatlara alternatif olabilecek yenilikçi nano formülasyonlar geliştirilmiştir.