Parkinson tedavisi için nöral farklılaşmış diş pulpası kök hücreleri-enjekte edilebilir polimer modeli: in-vitro çalışmalar
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MERVE ÇAPKIN YURTSEVER
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma 113S285 numaralı "İnsan Diş Pulpası Kök Hücrelerinin Dopaminerjik Nöronlara Farklılaştırılmasında Fotobiyomodülasyon Yapan Işık Kaynaklarının Etkinliğinin İncelenmesi" adlı TÜBİTAK projesi ve Hacette Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi 10875 kodlu proje destekleri ile hazırlanmıştır. Sunulan tez çalışmasının amacı, Parkinson hastalığının tedavisi için kimyasal ajanlar ve fotobiyomodülasyonun etkisi ile dopaminerjik nöronlara indüklenmiş kök hücreler ve niş işlevi görecek enjekte edilebilir polimerlerin birlikte kullanımının yeni bir transplante edilebilir sistem oluşturulması için incelenmesidir. İnsan diş pulpası kök hücreleri (iDPKH), Hacettepe Üniversitesi, Girişimsel Olmayan Klinik Araştırmalar Etik Kurulu'ndan alınan LUT 12/94 – 09 karar numaralı izin çerçevesinde izole edilmiştir. Akış sitometrisi yöntemi ile hücre yüzey antijenleri belirlenmiş, hücrelerin kemik, kıkırdak ve yağ hücrelerine farklılaşmaları incelenerek mezenkimal kök hücre karakteri taşıdıkları gösterilmiştir. Çalışmada, farklı kadın (K) hastalardan izole edilen iDPKH-K4, iDPKH-K8 ve 3 farklı kadın hastadan alınan hücrelerin karışımından oluşan iDPKH-1'ler kullanılmıştır. Fotobiyomodülasyon uygulamalarında, 590-1395 nm dalga boyu aralığında ışıma yapan plazma ark (PAC) ışık kaynağı ve düşük seviyeli 660 nm diyot lazer kullanılmıştır. PAC ışık kaynağının iDPKH'lerin canlılıkları üzerindeki etkisi, cihazın hücrelere 10 ve 15 cm uzaklıklardan 2.5 ve 5 dk uygulanması sonrası farklı günlerde MTT analizi ile incelenmiştir. Hücrelerin tüm koşullarda canlılıklarını korudukları, hücresel aktivitenin koşullar arasında belirgin bir fark göstermediği belirlenmiştir. Seçilen PAC uygulama koşullarında, Neurobasal A ortamında kültüre edilen hücrelerde, BDNF (beyin türevli nörotropik faktör), GDNF (glial hücre türevli nörotropik faktör) ve NGF (sinir büyüme faktörü) ekspresyonları incelendiğinde, özellikle BDNF ve GDNF'nin ekspresyonunun PAC uygulaması ile hiç bir kimyasal indükleyici ajan olmadan arttırılabileceği belirlenmiştir. NGF mRNA ekspresyonunun ise genel olarak fotobiyomodülasyon uygulamasından olumsuz yönde etkilendiği gösterilmiştir. Ayrıca, farklı hastalardan elde edilen hücrelerin fotobiyomodülasyon uygulamasına farklı cevaplar verdikleri görülmüştür. İnsan diş pulpası kök hücrelerinin dopaminerjik nöronlara indüksiyonu için SHH (sonic hedgehog), FGF8 (fibroblast büyüme faktörü 8), bFGF (bazik fibroblast büyüme faktörü), BDNF, GDNF ve TGF-β3 (transforme edici büyüme faktörü β3) gibi kimyasal ajanlar farklı konsantrasyonlarda ve sürelerde uygulanmıştır. Hücrelerde NURR1 (nükleer reseptör ilgili-1) ekspresyonunu arttıran en uygun koşulun, pre-indüksiyon faktörlerinin ilk 7 gün boyunca; SHH 200 ng/mL, FGF8 100 ng/mL ve bFGF 50 ng/mL konsantrasyonlarda, sonraki 7 gün boyunca her ortam değişiminde yarı yarıya azalan konsantrasyonlarda kullanıldığı, post-indüksiyon faktörlerinin ise; BDNF 10 ng/mL, GDNF 10 ng/mL ve TGFβ3'ün 20 ng/mL sabit konsantrasyonda uygulandığı koşul olduğu belirlenmiştir. Hücrelerde dopaminerjik nöronlara spesifik genlerin ekspresyonu gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-qPCR) ile belirlenmiştir. Bu amaçla mRNA ekspresyonları; NURR1, BDNF, GDNF, NGF, MAP2 (matriks ilgili protein 2), DAT (dopamin taşıyıcı protein), TH (tirozin hidroksilaz) ve PTX3 (pituitary homeobox 3) genlerine spesifik primerler kullanılarak incelenmiştir. Elde edilen sonuçlar, NURR1 ekspresyonunun pre-indüksiyon faktörleriyle tetiklendiğini ancak, post-indüksiyon faktörleri ile baskılandığını göstermiştir. Pre-indüksiyon faktörlerinin 14 gün boyunca kültür ortamında bulunmasının hücrelerde dopaminerjik mRNA ekspresyonlarını tetiklediği, post-indüksiyon ortamına geçilmesiyle azalan NURR1, BDNF ve GDNF ekspresyonlarının 11. günden sonra tekrar artış gösterdiği belirlenmiştir. Farklılaşma öncesi ve sonrası hücrelerde TH ve PITX3 mRNA ekspresyonu görülmemiştir. Hücrelerde TH enzimi immün boyama ile de incelenmiş ve enzim varlığına rastlanmamıştır. Fotobiyomodülasyon uygulamaları incelendiğinde, pre-indüksiyon ve post-indüksiyonun ilk günlerinde ve fazla sayıda uygulamanın hücrelerde dopaminerjik nöronlara spesifik genlerin ekspresyonunu inhibe ettiği, özellikle lazer gruplarında belirgin bir şekilde görülmüştür. Bu nedenle, optimize edilen dopaminerjik indüksiyon koşullarında hücrelere pre-indüksiyondan 4 gün sonra ve post-indüksiyondan 4 gün sonra olmak üzere iki kez fotobiyomodülasyon uygulanmasına karar verilmiştir. PAC uygulama mesafesi ve süresi sırasıyla kültür kabı yüzeyinden 10 cm uzaklıkta ve 2.5 veya 5 dk olarak, laser uygulaması için ise 10 dk veya 4 dk olarak seçilmiştir. Uygulanan toplam enerji yoğunluğu, PAC için cihazdan 1 cm uzaklıkta 78.0 J/cm2, 31.2 J/cm2 ve 660 nm lazer için (doğrudan hücrelere etkiyen) 1.584 J/cm2 ve 0.634 J/cm2 olarak belirlenmiştir. Dördüncü pasajdaki iDPKH-1'lerin dopaminerjik nöronlara indüksiyonu optimize edilen kimyasal indüksiyon ve fotobiyomodülasyon koşullarında incelenmiştir. Hücrelerde, özellikle dopaminerjik indüksiyonun ilk yedi gününde 660 nm lazerin 1.58 J/cm2 enerji yoğunluğunda uygulandığı grupta BDNF, GNDF, MAP2, NURR1 ve DAT gibi büyüme ve transkripsiyon faktörlerinin ekspresyonlarının anlamlı olarak arttığı RT-qPCR analizleri ile belirlenmiştir. PAC ışık kaynağının etkinliğinin de farklılaşma ortamına ve farklı protein yapısına bağlı olarak değiştiği gösterilmiştir. Hücrelerin dopaminerjik nöronlara spesifik mRNA ekspresyon düzeyleri hem kimyasal ajanlar hem de fotobiyomodülasyondan etkilense de farklılaşma süresi sonunda yüzeyden kaldırıldıklarında canlılıklarını koruyamadıkları belirlenmiştir. Dopamin alımının/salımının TH antikoru ile immün boyama, ELISA yöntemi ve Fluo-8® AM ajanı ile incelenmesi sonucunda olumlu sonuçlar elde edilememiştir. Hücrelerin uygulanan koşullarda fonksiyonel dopaminerjik nöronlara farklılaşamasalar da dopaminerjik nöronları koruyucu protein ekspresyonlarının 660 nm lazer ve PAC uygulamaları ile belli koşullarda arttırılabildiği tez çalışmasının önemli bir çıktısıdır. Enjekte edilebilir jel hazırlanması için %92.7 deasetilasyon derecesine sahip, tıbbi kullanıma uygun %3'lük (w/v) kitosan çözeltisi kullanılmıştır. Farklı hacimlerde 1 g/mL gliserol fosfat ve 0.18 g/mL genipin, kitosan çözeltisine eklenerek 37oC'de genipin çapraz bağlı hidrojeller elde edilmiştir. Hidrojellerin biyouyumluluğunu ve enjekte edilebilirliğini arttırmak ve jelleşme süresini azaltmak için laminin çözeltisi (50 μL/100 μL, 1 mg/mL) eklenmiştir. 0.5 mM genipin ve 50 μL (1 mg/mL) laminin içeren enjekte edilebilir kitosan jel hücre kültürü çalışmaları için seçilmiştir. Seçilen jelin elastisite modülü ve viskozitesi 37oC'de 3 saat jelleşmeden sonra sırasıyla, 3.0 Pa ve 0.3 Pa.s'dir. Canlı dokudaki jel bütünlüğü sıçan deri altına yapılan enjeksiyon ile gösterilmiştir. Jelleşme başında yapılan enjeksiyonda jel yapısının oluşmadığı ve dağıldığı ancak, 37oC'de 2-3 saatlik jelleşmeden sonra jel ile hücreler karıştırıldığında deri altında jel bütünlüğünün korunduğu görülmüştür. Dopaminerjik yol izinde kimyasal ajanlar ve fotobiyomodülasyonun etkisiyle indüklenen hücrelerin enjekte edilebilir jeller içerisindeki canlılıkları canlı/ölü hücre analizi ile incelenmiştir. Jelleşme başladıktan belli bir süre sonra hücreler 1000-1500 hücre/µL jel oranında 37oC'de karıştırılmıştır. En yüksek hücre canlılığının laminin katkılı 0.5 mM genipin ile çapraz bağlı jellerde olduğu görülmüştür. Jel yapısına %5 FBS (fötal sığır serumu) ve %1 L-glutamin eklendiğinde hücre canlılığının arttırılabildiği belirlenmiştir. Genipin ile çapraz bağlı kitosan/laminin biyopolimerleri ile enjekte edilebilir bir jel oluşturulabildiği, jelin elastik modülünün beyin dokusu için uygun olduğu, hücrelerin jel ile homojen olarak karıştırılabildiği ve jel içerisinde askıda kaldıkları için transplantasyon sırasında kümelenme eğiliminin önlenebileceği ve modifikasyonlar ile jel içerisinde hücre canlılığının iyileştirilebildiği yapılan çalışmalar ile gösterilmiştir. Elde edilen bulgular, iDPKH'lerin kimyasal ajanlar varlığında ve fotobiyomodülasyon etkisi ile dopaminerjik nöronlara indüklenebildiğini ve genipin ile çapraz bağlı kitosan/laminin enjekte edilebilir jel desteği ile bu hücrelerin Parkinson hastalığında alternatif bir tedavi yaklaşımı olabileceğini göstermektedir.