Sitokrom c saflaştırılması için süpermakrogözenekli immobilize metal afinite kromotografi adsorbentler
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: DUYGU ÇİMEN
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): ADİL DENİZLİ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sitokromlar, kendilerine has görünür bölge spektrumlarına sahip kırmızı kahverengi hem proteinleridir. Elektron transfer sistemlerindeki sitokromlar genellikle absorpsiyon spektrumlarındaki dalga boyuna bağlı olarak a, b, c gibi harflerle tanımlanmaktadırlar. Sitokromlar içerdikleri metal iyonu üzerinden yükseltgenme indirgenme reaksiyonlarına uğrarlar.Kriyojeller, monomer veya polimer başlatıcıların kısmi olarak dondurulmuş çözeltilerde hazırlanmış jel matrislerdir. Birbirleri ile bağlantılı makrogözeneklerden oluşurlar ve ozmotik, kimyasal ve mekanik özellikleri sayesinde birçok biyolojik uygulamada kullanılırlar.İmmobilize metal afinite kromotografisi (İMAK); terapötik proteinlerin, peptitlerin, nükleik asitlerin, hormonların ve enzimlerin saflaştırılması için yaygın olarak kullanılan bir analitik ayırma yöntemidir. Birçok geçiş iyonu elekronca zengin bileşiklerle kararlı kompleksler oluştururlar ve O, N, S içeren moleküllerle iyon dipol etkileşimleriyle koordinasyon bağı kurarlar. Birinci sıra geçiş metal iyonları (Zn2+, Ni2+, Cu2+ ve Fe3+) iminodiasetikasit, nitriloasetik asit ve tris(karboksimetil) etilendiamin gibi bileşikler üzerinden kompleksleştirilerek İMAK sorbenti elde edilir. İMAK'da biyomoleküllerin şelatlanmış metal iyonlarına olan afiniteleri temeline göre ayırma sağlanır.Bu çalışmada Cu2+ bağlı poli(2-hidroksietil metakrilat-N-metakriloil-(L)-histidin metil ester), PHEMAH, temelli kriyojeller destek malzemesi olarak kullanılarak İMAK yöntemiyle sitokrom c saflaştırılmıştır. Elementel analiz ile azot stokiyometrisinden faydalanılarak PHEMAH kriyojelin yapısına katılan MAH miktarı 113.7 µmol/g polimer olarak bulunmuştur. İkinci basamakta PHEMAH kriyojele Cu2+ iyonları takılmıştır. Cu2+ bağlanma miktarı 58.7 µmol/g'dır. Hazırlanan adsorbentin sitokrom c bağlama özellikleri farklı koşullarda sitokrom c'nin sulu çözeltilerinde incelenmiştir. PHEMAH kriyojelin maksimum adsorpsiyon miktarı 3.1 mg sitokrom c/g adsorbenttir. Cu2+ takılması adsorpsiyon miktarı önemli derecede artırmıştır. Cu2+ bağlı PHEMAH kriyojelin pH=8.0 fosfat tamponunda maksimum adsorpsiyon miktarı 20.8 mg sitokrom c/g adsorbent olarak belirlenmiştir. Adsorpsiyon miktarı akış hızının 0.5 ml/dk'dan 3.5 ml/dk'ya çıkarılması ile 12.37 mg sitokrom c/g adsorbentten 5.82 mg sitokrom c/g adsorbent değerine düşmüştür. Sprague dawley sıçan karaciğerinden elde edilen maksimum sitokrom c adsorpsiyon miktarı 1 gram polimer başına 37.7 mg olarak bulunmuştur. İMAK ile saflaştırılan sitokrom c'nin molekül ağırlığı ve saflığı standart sitokrom c ile karşılaştırılarak SDS-PAGE (sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi) ile belirlenmiştir. Sitokrom c'nin kriyojel kolondan desorpsiyonu için 1 M NaCl kullanılmıştır. Sitokrom c'nin adsorpsiyon kapasitesinde önemli bir azalma olmadan PHEMAH-Cu2+ kriyojel kolona tekrar tekrar adsorbe ve desorbe edilebileceği gösterilmiştir.