Hidrofobik etkileşim kromatografisi ile plazmid dna saflaştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: RECEP ÜZEK
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): SERAP ŞENEL
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Plazmid DNA (pDNA) izolasyon ve saflaştırılması için Hidrofobik Etkileşim Kromatografisi (HIC) tercih edilmiştir. Bu amaçla, nano-iğneler içeren poli(2-hidroksietilmetakrilat-matekriloilamidofenilalanin), poli(HEMA-MAPA) kriyojeller hazırlanmıştır. MAPA monomeri L-fenil alaninin metakriloil klorür ile reaksiyonu sonucunda sentezlenmiştir. Yapısı 1H NMR ve FTIR yöntemleri ile incelenmiştir. Kriyojel sentezinde klasik yöntem izlenmiş, nano-iğneler oluşturarak yüzey alanının artırılması için dondur-kurut (freeze-drying) basamağı eklenmiştir. Karşılaştırma amacıyla poli(HEMA) kriyojelleri de sentezlenmiştir. BET analizleriyle poli(HEMA) kriyojelinin yüzey alanı 21.35 m2/g ve poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin ise 36.00 m2/g olarak belirlenmiştir. Hazırlanan poli(HEMA-MAPA) kriyojelinin yapısına giren MAPA miktarı 67.12 µmol/g polimer olarak elementel analiz sonuçlarıyla belirlenmiştir. Yapı içerisindeki MAPA monomerinin varlığı FTIR analizleri ile de ispatlanmıştır. Kriyojellerin içyapısı ve yüzey özellikleri taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile incelenmiştir.Sulu çözeltiden pDNA izolasyonu için 5 mL hacimde (1.20 cm çapında) kolonlar kullanılarak sürekli sistemde adsorpsiyon kapasitesini etkileyen bazı parametreler araştırılmıştır. DNA derişimi UV-görünür spektrofotometrede 260 nm'de ölçülen absorbans değerleri ile hesaplanmıştır. 25oC'de, optimum pH 5.5'de DNA adsorpsiyon kapasitesi 13.98 mg DNA/g kriyojel'dir. Başlangıç derişiminin adsorpsiyon kapasitesine olan etkisi incelendiğinde maksimum adsorpsiyon kapasitesi poli(HEMA) için 8.28 mg/g ve poli(HEMA-MAPA) için ise 45.31 mg/g'dır. Adsorpsiyon kapasitesi iyonik şiddet artışı (maksimum kapasite Na2SO4 ile elde edilmiştir) ve sıcaklık artışı ile (40oC'de maksimum kapasite 15.69 mg/g'dır) artmıştır. Desorpsiyon ajanı asetat (pH 5.5) tamponudur. 1 saatlik uygulama süresi için desorpsiyon oranı %91.57`dir. İzlenen 15 çevrim için adsorpsiyon kapasitesindeki küçük değişmeler (13.65 mg/g'dan 12.50 mg/g'a) matrisin tekrar kullanılabilirliğinin göstergesidir.Adsorpsiyon verileri Langmuir modeline uymuştur. Adsorpsiyon kinetiği yalancı-ikinci derece modeline daha uygun bulunmuştur. Farklı sıcaklıklarda Langmuir modeli uygulanarak ?Ho, ?So ve ?Go değerleri hesaplanmıştır.Poli(HEMA-MAPA) kriyojelleri ile E.coli lizatından izole edilen pDNA'nın saflığının ve molekül ağırlığının belirlenmesi için agaroz jel elektroforez çalışmaları yapılmıştır. Kriyojel süper sarmal (SC) pDNA ile kuvvetli etkişime girmektedir ve elüsyondaki pDNA'nın SC formunun baskın olması bunun göstergesidir. İzole edilen pDNA'nın yaklaşık 7000 baz çifti'ne (bç) sahip olduğu bulunmuştur.Hızlı Protein Sıvı Kromatografisi (FPLC) tekniğiyle poli(HEMA-MAPA) kriyojellerinin safsızlıklara göre pDNA'ya 237.5 kat daha fazla seçicilik sağladığı bulunmuştur.