In vitro şartlarda mutant AVPR2 proteinlerinin yarı ömür ve glikozilasyon özelliklerinin araştırılması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HÜSEYİN ÖZGÜR ÖZDEMİREL
Danışman: Hatice Mergen
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Diabetes insipidus (DI), aşırı miktarda idrar oluşumu (poliüri) ve aşırı miktarda susama (polidipsi) ile karakterize olmuş bir hastalıktır. Sebeplerine göre Gestasyonel DI, primer polidipsi, Nefrojenik DI (NDI) ve Santral DI (CDI) olmak üzere sınıflara ayrılır. NDI hastalığı kazanılmış veya kalıtsal olabilir. Kalıtsal NDI, %90 oranla X kromozomu (Xq28) üzerinde bulunun AVPR2 genindeki mutasyonlardan kaynaklıdır. AVPR2 proteinin 371 amino asitlik kodlanan DNA'sında gerçekleşen bir mutasyon, farklı semptomlarla gözlemlenebilen bu hastalığın ortaya çıkmasına neden olur. Ortaya çıkan bu mutasyonlar nedeniyle, AVPR2 proteini yanlış katlanır ve degradasyona yönlendirilir. Bu durum, proteinin yarı ömrünü değiştirmektedir. Hücre içi proteomun yarı ömrü, birkaç dakika ile birkaç ay arasında değişiklik gösterir. Bu değişikliğin sebebi ise hücre döngülerinde ve çeşitli çevresel/fizyolojik durumlarda verilen hücresel cevaba bağlı olarak protein degradasyon oranının farklılık göstermesinden kaynaklanmaktadır. Mutasyon sebebiyle gerçekleşen degradasyon hızının artışı veya azalışı ise proteinin geçirdiği glikozilasyon modifikasyonlarıyla bağlantılıdır. AVPR2 geninde meydana gelen, grubumuz tarafından tanımlanan G12E, H80Y, V88M, V88L, R106C, V215M ve L219P mutasyonlarına ait yarı ömür zamanlarını ve glikozilasyon modifikasyonlarını ortaya koymak, yapılan bu tezin amacıdır. Bu kapsamda yapılan deneysel çalışmalarda, yabanıl tip kodlayıcı AVPR2 dizisi taşıyan ifade vektörü kullanılarak, site-directed mutagenez yöntemi ile ilgili mutant AVPR2 gen dizilerini içeren ifade vektörleri hazırlanmıştır. COS-7 hücrelerinde ifade olması sağlanan mutant proteinlerin hücre içi olgunlaşma sürecinin karakterizasyonun araştırılması için deglikozilasyon deneyleri gerçekleştirilmiştir. Ayrıca proteinlerin yarı ömürlerinin belirlenmesi amacıyla, siklohekzimid analizi yapılmış ve hem deglikozilasyon deneyleri hem de siklohekzimid deneylerine ait sonuçlar immünblot analizi ile değerlendirilmiştir. Böylece mutant proteinlerin degradasyon durumları ve geçirdiği glikozilasyon modifikasyonları arasındaki ilişki ortaya koyulmuştur. Sonuç olarak her mutantın, ER'de farklı düzeylerde takılı kaldığı görülmektedir. Yarı ömür zamanlarının, direkt olarak proteinin işlevselliği ve oluşturduğu sinyal cevabı ile ilişkili olmadığı ve glikozilasyon modifikasyonlarıyla birlikte değerlendirildiğinde bir anlam taşıdığı düşünülmektedir. Yarı ömür değerleri için mutantlar ile yabanıl tip karşılaştırmaları, her mutant için istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur. Elde edilen sonuçlara göre L219P en düşük yarı ömür değerine sahiptir ve deglikozilasyon sonuçları ile değerlendirildiğinde büyük bir kısmının ER'de takılı kaldığı görülmüştür. R106C mutantına ait yarı ömür değerinin arttığı ve bu durumun degradasyon mekanizmalarının inhibisyonu ile ilişkili olabileceği önerilmiştir. H80Y mutant proteinin ise en uzun yarı ömür uzunluğuna sahip olmasına rağmen, deglikozilasyon analizi ile değerlendirildiğinde büyük bir kısmının ER'de takılı kaldığı gözlemlenmiştir. Yarı ömür uzunluğunun yabanıl tipe yakınlık göstermesi ise mutant proteinin ER'den çıkışa ve degradasyona direnç göstermesiyle ilişkilendirilmiştir. AVPR2 proteininin farklı noktalarında ve farklı amino asit değişimleriyle meydana gelen bu mutasyonlar, farklı etki mekanizmalarına sahip olup bu durum, kalıtsal NDI'nın, hastalar arasında değişim gösteren semptomlarını açıklamaya yardımcı olabilecektir.