Yüzeye modifiye edilen aptamer uç gruplarının aptamer-protein etkileşimlerine etkisinin kütle spektrometresi ile incelenmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: FUNDA YILDIRIM
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): BEKİR SALİH
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Aptamerler farklı özelliklerle sentezlenebilen ve hedef moleküllerine (protein, enzim, virüs, hormon vb.) yüksek seçicilikle bağlanabilen deoksiribonükleik asit (DNA) veya ribonükleik asit (RNA) zincirleridir. Aptamerler, antikorların zayıf özeliklerini ortadan kaldırarak, araştırmalarda antikorların yerine kullanılmalarıyla bilinmektedirler. Aptamerler tek zincirli doğal DNA veya RNA moleküllerinden seçilirler. Geniş biyoanalitik uygulamalardaki fonksiyonlarını ve bağlanmalarını arttırmak için aptamerler 3' ve 5' uçlarından çeşitli gruplarla (-NH2, -SH vb.) modifikasyona uğratılırlar. Aptamerler, biyolojik örneklerde düşük miktarlarda bulunan proteinlerin tayinlerinde biyo-işaretleyici (biomarker) olarak kullanılabilirler ve bu sayede karmaşık protein karışımlarından hedef molekülün izole edilmesini sağlarlar. Böylelikle, teşhis ve tedavi edici özelliğe sahip olan hücresel hedefler için seçilen aptamerler sayesinde kanser hücresi ve tümör tayinleri gibi uygulamalarda çok önemli ilerlemeler kaydedilmektedir. Bu tür uygulamaların geliştirilmesi için aptamer-hedef molekül etkileşimlerinin dayandığı bilimsel temellerin belirlenmesi çok önemlidir. Aptamerlerin yukarıda da bahsedilen eşsiz özelliklerinden dolayı, tez kapsamında yapılan çalışmalarda yüzeye modifiye edilen aptamer uç gruplarının aptamer protein etkileşimlerine etkileri araştırılmıştır. Trombin aptamer çeşidinin etkilerinin gözlenmesi için 24 farklı modifiye aptamer hedef insan trombin proteini ile etkileştirilmiştir. Öncelikle, 5' ve 3' uçlarında farklı sayıda baz birimine sahip trombin aptameri kovalent olarak tiyol (-SH) veya amin ( -NH2) fonksiyonel gruba sahip uçlarından Sülfo-Süksinimidil-4-(N-maleimidomethyl) siklohekzan-1-karboksilat (Sülfo-SMCC) ya da Bis(sülfosüksinimidil süberat) (BS3) uygun çapraz bağlayıcılarından biri kullanılarak amin fonksiyonlu polimerik yüzeye sabitlenmiştir. Yüzeye sabitlenen her bir aptamer 3,5 pmol/ µL insan trombin protein ile muamele edilmiştir. Katı destek yüzeyine kimyasal bağla bağlanan aptamerle etkileştirilip seçimli olarak zenginleştirme işleminin ardından, katı yüzeyde tripsin enzimi ile parçalama uygulanmıştır. Trombinin triptik parçalama ürünlerinin tanımlama ve dizilim analizleri matriks-yardımlı lazer desorpsiyon/iyonlaştırmalı-kütle spektrometrisi (Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization-Mass Spectrometry, MALDI-MS) ile gerçekleştirilmiştir. Her etkileşim için etkin aptamer-protein etkileşimleri karşılaştırılmıştır. Kütle spektrumlarında uç grubunda 6 timin baz birimi bulunan aptamerlerde trombin peptit fragmentleri ile daha fazla karşılaşılmıştır. Bunun yanı sıra, aptamer ile zenginleştirme işlemi gerçekleştirilerek birçok proteinin bulunduğu karmaşık çözelti örneğinden trombin zenginleştirilmesi uygulanmıştır. MALDI-MS analiz sonuçları incelenerek trombinin karmaşık bir örnekten tezde geliştirilmiş yöntem kullanılarak aptameri tarafından seçilebileceği görülmüştür.