İNTRATÜMÖRAL UYGULAMAYA YÖNELİK NANOLİPOZOM FORMÜLASYONLARININ GELİŞTİRİLMESİ


Thesis Type: Postgraduate

Institution Of The Thesis: Hacettepe University, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji Ve Nanotıp A.B.D., Turkey

Approval Date: 2019

Thesis Language: Turkish

Student: Ümran Yaman

Consultant: İpek Eroğlu

Abstract:

Malign melanom, deride melanin üretimini sağlayan melanosit hücrelerinden kaynaklanan ve ölüm oranı en yüksek cilt kanseri türü olarak bilinmektedir. Metastaz gerçekleştiğinde, cerrahi yöntemlerle müdahale, tedavi için tek başına yeterli olmamaktadır. Bir pirimidin analoğu olan 5-Florourasil (5-FU), birçok kanser türünün tedavisinde yaygın olarak kullanılan sitotoksik bir ilaçtır. 5-FU,  cerrahi yöntemlerin hasta için uygun olmadığı durumlarda, cilt kanserinin tedavisinde topikal formda uygulanmaktadır. Fakat deriden penetrasyonu yeterli olmadığı için, tedavi süresi sınırlı kalmakta ve epitel dokuya penetre olan ilaç konsantrasyonunun yetersiz olması sebebiyle, etkin tedavi sağlananamaktadır. Günümüzde, kemoterapötik ajanların direkt istenen dokuda birikimini sağlamak, buna bağlı terapötik etkinliğini artırmak ve yan etkilerini azaltmak amacıyla, nanotaşıyıcı sistemler sıklıkla kullanılmaktadır. Bu sistemler arasında yer alan nanolipozomlar, biyolojik membranlara benzer yapıda olmaları nedeniyle biyouyumlu olup, yüksek penetrasyon kabiliyetine sahiptirler. Tez kapsamında, intravenöz uygulamaları takiben yarılanma ömrü kısa olan (6-20 dk), dokulara geniş dağılım gösteren ve dermatit, kardiyak toksisite, merkezi sinir sistemi hasarı gibi yan etkilere neden olan 5-FU etkin maddesinin, nanolipozom formülasyonları hazırlanmıştır. Kontrollü salım yapabilen bu formülasyonlar ile, hem terapötik etkinin arttırılması hem de yan etkilerin azaltılması amaçlanmıştır.

Son yıllarda, malign melanom tedavisinde sadece ilaç uygulamalarının yetersiz kaldığı, ilaç/gen kombinasyonu içeren formülasyonların geliştirildiği gözlenmiştir. Tez kapsamında, ileri dönem gen uygulama çalışmalarına yönelik formülasyonlar tasarlamak için, 5-FU yüklü nanolipozomlara, yüzey kaplama/modifikasyon işlemleri yapılmıştır. Bu amaçla öncelikle, anyonik ve katyonik lipitler ile yüzey yükü değiştirilmiş nanolipozom formülasyonları hazırlanmış, daha sonra polimer ile kaplanarak modifikasyon işlemi uygulanmıştır. Katyonik lipit olarak stearilamin (SA) ve anyonik lipit olarak disetilfosfat (DCP) kullanılarak nanolipozomlar hazırlanmış, Poli-L-lizin (PLL) ve Polietilenimin (PEI) kullanılarak polimerik kaplama işlemi gerçekleştirilmiştir. 

 

Tez kapsamında öncelikle yöntem ve formülasyon optimizasyon çalışmaları yürütülmüştür. Bu amaçla; 5-FU yüklü katyonik ve anyonik özellikteki nanolipozom formülasyonları ince film tabaka oluşturma yöntemi ile hazırlanmış ve farklı parametrelerin (sonikasyon süresi, lipit yapısı, pozitif/negatif lipit oranı, pH ve sürfaktan etkisi), formülasyon karakterizasyon parametreleri (partikül boyutu (PB), zeta potansiyeli (ZP), polidispersite indeksi (PDI) ve enkapsülasyon etkinliği (EE)) üzerine etkileri değerlendirilmiştir. Ardından nanolipozomlar polimer ile kaplanmış ve fiziyokimyasal özellikler tekrar değerlendirilmiştir. Formülasyonların, yüzey karakterizasyonu, moleküler yapıları ve termal özellik aydınlatması, sırasıyla SEM, FTIR ve TGA-DSC analizleri ile gerçekleştirilmiş, stabilite çalışmaları yürütülmüştür. Optimize edilen formülasyonlar ile in-vitro salım çalışmaları yapılmış, ardından A431 epidermal karsinom hücre hattı üzerinde etkileri incelenmiştir. 

 

Optimum formülasyon olarak dipalmitoilfosfatidilkolin (DPPC), DCP ve kolesterol (7:2:1 molar oran) ile hazırlanan, 5-FU yüklü nanolipozom (Lipo-FU) (%EE ~ 42) ve 5-FU yüklü PLL kaplı nanolipozom (PLL-Lipo-FU) (%EE ~ 88) seçilmiştir. İn-vitro salım deneyleri, Lipo-FU, PLL-Lipo-FU ve 5-FU çözeltisi kullanılarak, diyaliz membran yöntemi ile yapılmıştır. Çözelti formu ile kıyaslandığında,  Lipo-FU ve PLL-Lipo-FU formülasyonlarının her ikisiyle de sürekli salım profili elde edilmiştir. Bu formülasyonlar ile, sırasıyla 1. saatin sonunda %47.17 ve %20.84 oranda salım (p<0.05) elde edilmiştir. Salım profillerine kinetik modeller uygulandığında, Lipo-FU formülasyonunun birinci derece kinetik modele (r2=0.9675), PLL-Lipo-FU formülasyonunun ise Higuchi kinetik modeline (r2=0.9918) uyum sağladığı tespit edilmiştir.Son olarak, formülasyonlarının hücre canlılığı üzerine etkileri değerlendirilmiş ve etkin madde içermeyen formülasyonların (Lipo ve PLL-Lipo) hücreler için toksik olmadığı saptanmıştır.

Sonuç olarak, nanolipozomlar ile uzun süreli etki elde edilerek, 5-FU’nun yarılanma ömrünün uzatıldığı, tekrarlayan dozlarda kullanımın önlenmesine bağlı olarak yan etkilerinin azaltıldığı ve hasta uyuncunun arttırılabildiği formülasyonlar geliştirilmiştir. PLL kaplı nanolipozom formülasyonunun, nano boyutu ve yüksek penetrasyon kabiliyeti nedeniyle, arttırılmış geçiş ve alıkonma (EPR) etkisi ile intratümöral uygulamayı takiben, vasküler bir tümör olan malign melanom tümörlerinde, lokal seviyede artmış bir terapötik cevap oluşturabileceği öngörülmüştür. Ayrıca formülasyon yüzeyinin nükleik asit bağlanmasına elverişli olması sebebiyle, kombine ilaç/gen terapi uygulamaları için aday nanolipozom modeli geliştirilmiştir.