Şap aşısı üretiminde kullanılan 146 S testine alternatif kromatografik yöntem geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ALİ DEMİRTAŞ
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Şap hastalığı, çift tırnaklı hayvanlarda görülen, ekonomik açıdan büyük bir öneme sahip olan viral ve çok bulaşıcı bir hastalıktır. Hastalığın Türkiye gibi endemik olarak seyrettiği ülkelerde, coğrafi ve ekonomik koşullardan dolayı hastalıkla mücadelede koruyucu aşı uygulamalarının büyük önemi bulunmaktadır. Kullanılan aşılar 146 S partikülü olarak adlandırılan tam virüs partikülü konsantrasyonuna göre formüle edilmektedir. Etkin koruma sağlayan ve kazançlı bir aşı üretimi için uygun dozda formülasyon çok önemlidir. Yeterli miktarda antijen içermeyen aşılar hayvanlarda istenilen düzeyde koruma oluşturamamakta; ya da aşı içerisine daha fazla antijen konularak aşı maliyeti gereksiz yere artırılmaktadır. Standart sapması ve hata olasılığı düşük, güvenilirliği yüksek bir test yöntemi ile en uygun aşı formülasyonu gerçekleştirilebilir. Bu çalışma ile Şap Enstitüsünde viral antijen miktarının tespiti amacıyla rutin olarak kullanılmakta olan 146 S testine alternatif olarak veya onunla birlikte kullanılabilecek kromatografik bir yöntem geliştirilmeye çalışılmıştır. Bu amaçla yapılan çalışmada iyon değişim kromatografisinin kullanımına yer verilmiş ve şap virüsünün izoelektrik pH değerine uygun olan ticari kolonlar kullanılmıştır. Kolon matriksi güçlü katyonik yapıya sahip, anyon değiştirici Q Sepharose XL matriksidir. Aynı matrikse sahip HiPrep Q XL 16/10 ve HiTrap Q XL 5 mL kolonları ile FPLC (Fast protein liquid chromatography) cihazında metot belirleme çalışmaları yapılmış olup, sonraki deneylerde daha hızlı ve uygun sonuç veren HiTrap Q XL 5 mL kolonu kullanılmıştır. Elüent olarak 20 mM Tris-HCL + 1 M NaCl (pH 7,5) tamponu kullanılmıştır. UV dedektör dalga boyu 254 nm değerinde daha düzgün kromatogramlar elde edilmiştir. Deneylerde akış hızı 5 mL/dk seviyelerine kadar çıkartılmıştır. Başarılı bir şekilde ayrımı yapılan piklerden fraksiyonlar toplanmış ve RT-PCR, ELISA, CFT testleri yardımı ile kromatogramdaki 146 S antijenini içeren pik belirlenmiştir. Devam eden çalışmalarda nükleaz enzimi ile muamele edilmiş numuneler ile de çalışılmış olup konakçı hücre DNA'sının 146 S pikine bir etkisi olmadığı görülmüştür. Kromatogramdaki pikler Unicorn Manager 5.11 programı ile analiz edilmiş ve pik alanları hesaplanmıştır. Daha sonra hesaplanan 146 S piki alan değeri ile numunelerin 146 S değerleri grafiğe geçirilmiş ve regresyon analizi Microsoft Excel yardımı ile yapılmış olup, yüksek R2 değerleri (0,97- 0,98) elde edilmiştir. Farklı derişimlerde numuneler ile deneyler yapılarak test yönteminin doğrusallığı değerlendirilmiş ve yapılan regresyon analizi sonucuna göre 0,97-0,99 R2 değerleri elde edilmiştir. Gerçekleştirilen çalışmanın neticesinde; iyon değişim kromatografisi yöntemi kullanılarak, FPLC cihazında, Q Sepharose XL kolonları ile şap virüsünün başarılı bir şekilde ayırımı yapılmıştır. Bu kapsamda geliştirilen test yönteminin Şap Enstitüsü'nde kullanılan 146 S testine alternatif olabilecek, tekrarlanabilir analiz sonuçlarının elde edilebileceği, kolay ve kısa sürede uygulanabilen geçerli bir test yöntemi olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır. Anahtar kelimeler: Şap Hastalığı, 146 S testi, İyon değişim kromatografisi, FPLC, Şap virüsü.