Hayvansal hücre/hücresel ürün üretimi için sıcaklık duyarlı mikrotaşıyıcıların sentezi ve karakterizasyonu
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HEDİYE ÖZGEN TİMUÇİN
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Mikrotaşıyıcı-destekli kültürler, memeli hücreleri kullanarak viral aşılar ve biyolojik hücresel ürünlerin üretimi amacıyla van Wezel tarafından geliştirilmiştir. Polimerik mikrotaşıyıcılar süspanse ortam koşullarında geniş yüzey alanı sağlayarak hücrelerin büyük miktarlarda üretimine olanak verirler. Çeşitli biyolojik ürünlerin analitik ve endüstriyel boyutta üretimi için geliştirilmiş çok sayıda ticari mikrotaşıyıcı mevcuttur. Mikrotaşıyıcıların doku mühendisliğindeki kullanımı ise sınırlıdır. En yaygın olarak kullanılan mikrotaşıyıcılar dekstran-temelli matrisler (Cytodex®) olup, kıkırdak ve kemikden türetilmiş hücreler de dahil olmak üzere çok sayıda hücrenin yapışma ve üremesini desteklemektedirler. Doygunluğa ulaşmış hücreler mikrotaşıyıcı yüzeyinden proteolitik enzimlerin, örneğin tripsin, yardımıyla kaldırılırlar. Ancak tripsin kullanımı çok sayıda dezavantajı beraberinde getirmektedir.Çevre sıcaklığındaki değişimlere karşı hacimsel geçişlerle cevap veren sıcaklık-duyarlı hidrojellerin hücre kültürlerinde hücre-destek malzemesi olarak kullanımları giderek artan bir ilgiye maruz kalmaktadır. Sıcaklık-duyarlı polimerlerde, hücre kültürü sıcaklığındaki değişimlerle hücrelerin yüzeye yapışma davranışlarının incelendiği çok sayıda çalışma mevcuttur. Sıcaklık-kontrollu hücre yapışma/kaldırma çalışmalarında en çok kullanılan polimer poli(N-izopropil akrilamid) (PNIPAAm)'dır. PNIPAAm yüzeye 37oC'de yapışıp üreyen hücreler sıcaklığın PNIPAAm'in ?en düşük kritik çözünme sıcaklığı?nın (LCST=32oC) altına düşürülmesiyle, tripsin veya EDTA kullanımına gerek olmaksızın yüzeyden kendiliğinden kaldırılırlar. PNIPAAm-aşılanmış doku kültür kapları (TCPS), hücre-hücre etkileşimlerini ve ekstrasellüler matris etkileşimlerini ortadan kaldırmadan hücrelerin tabaka halinde yüzeyden kaldırılmasına olanak verir. Sıcaklık-duyarlı polimerleri TCPS yüzeyine kaplamak için çok çeşitli yöntemler mevcuttur. Örneğin, elektron demeti polimerizasyonu, kovalent bağlama, plazma yük boşalımı, UV-ışını radyasyonu gibi. Tüm bu yöntemler hücre-tabaka mühendisliği uygulamaları için TCPS yüzeylere uygulanmıştır. Ancak, şu ana kadar hücre ve hücresel ürünlerin büyük ölçekte üretimine yönelik sıcaklık-duyarlı bir mikrotaşıyıcı geliştirilmemiştir.Yapılan çalışmanın ilk kısmında, yüzeye-bağımlı karakterdeki hayvansal hücrelerin kayma kuvvetlerinin etkisinden korunarak büyük-ölçekli reaktörlerde üretimine ve proteolitik enzim ve şelasyon ajanı kullanılmaksızın yüzeyden kaldırılmalarına olanak sağlamak amacıyla üç tür mikrotaşıyıcı (PNIPAAm-g-PHEMA, PNIPAAm-g-PVA, PNIPAAm-g-dekstran) sentezlenmiştir. Mikrotaşıyıcı sentezi biyouyumluluğu yüksek dekstran doğal polimeri ile poli (hidroksietilmetakrilat) (PHEMA) ve poli(vinilasetat-hidroksi) (PVA) sentetik polimerleri kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Sıcaklık-duyarlılık özelliği, atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP) yöntemi kullanılarak, poli(N-izopropilakrilamid) (PNIPAAm) ile sağlanmıştır. Sentezlenen mikrotaşıyıcılar, ATR-FTIR, XPS (ESCA), AFM, SEM ve şişme deneyleriyle karakterize edilmiştir.Çalışmanın ikinci kısmında, sentezlenen mikrotaşıyıcıların hayvansal hücre kültürlerinde kullanılabilirliklerinin belirlenmesi ve optimum özellikleri sağlayan mikrotaşıyıcı seçiminin yapılması amacıyla sentezlenen mikrotaşıyıcılar ile hücre kültür çalışmaları gerçekleştirilmiştir. İlk olarak statik kültür ortamlarında çalışılmış, ardından karıştırmalı reaktör kullanılarak dinamik kültür koşulları sağlanmıştır. Statik kültür çalışmaları sonunda PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcılar dışındaki mikrotaşıyıcıların hücre yapışması ve üremesini istenilen düzeyde desteklemediği belirlenmiştir. Bu nedenle dinamik kültür çalışmaları yalnızca PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcılar ile yürütülmüştür. Hücre kültür çalışmalarında farklı morfolojiye sahip 2 tür hücre hattı (L929 fare fibroblast hücreleri ve HS2 insan keratinositleri) kullanılarak, mikrotaşıyıcılara yapışma ve yüzeyden kopma açısından hücre morfolojisinin etkisi karşılaştırılmıştır.Yapılan hücre kültürü çalışmalarının sonucunda, sentezlenen mikrotaşıyıcılardan PNIPAAm-g-PHEMA mikrotaşıyıcıların özellikle dinamik koşullarda hücre üretimi için uygun olduğu ve sıcaklık-duyarlık etkisi ile hücrelerin yüzeyden geri kazanımında kullanılabilecekleri sonucuna varılmıştır. Ayrıca hücre morfolojisinin de üretimi etkileyeceği tespit edilmiştir. Böylelikle gerek doku mühendisliği uygulamaları için yüksek sayıda hücre üretmek, gerekse yüksek kapasitede hücresel ürün üretimini kolaylıkla ve etkin bir biçimde gerçekleştirmek mümkün olacaktır.Anahtar Kelimeler: Mikrotaşıyıcı-destekli kültür, atom transfer radikal polimerizasyonu (ATRP), biyoreaktör, hücre kültürü, sıcaklık-duyarlı polimer.