Mezenkimal kök hücrelerin osteojenik farklılaşmasında çeşitli biyoreaktör performanslarının karşılaştırılması
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: IŞIL GERÇEK BEŞKARDEŞ
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sunulan tez çalışmasında, doku iskelesi destekli biyoreaktörlerde mezenkimal kök hücrelerin üreme ve osteojenik farklılaşma potansiyellerinin incelenmesi amaçlanmıştır. Bu amaca yönelik olarak gerçekleştirilen deneysel çalışmalarda kitosan-hidroksiapatit süpergözenekli hidrojeller (kitosan-HA SPHC) ve ipek doku iskeleleri kullanılmış, durgun kültür ile karşılaştırmalı olarak basit karıştırmalı kap biyoreaktör ve perfüzyon biyoreaktörlerde dinamik kültür sistemleri yürütülmüştür. Kitosan-HA SPHC'lerin üretimi mikrodalga ışıma ve gaz köpükleştirme yöntemlerinin birleştirilmesiyle gerçekleştirilmiş; üç boyutlu, gözenekli yapısı Taramalı Elektron Mikroskobu (SEM) ve Bilgisayar Destekli Mikro Tomografi (µCT) analizleriyle görüntülenmiştir. Basit karıştırmalı kap biyoreaktörde 50 rpm karıştırma hızında gerçekleştirilen 28 günlük çalışmada, durgun ve dinamik koşullarda kültüre edilen sıçan adipoz doku kaynaklı mezenkimal kök hücrelerin (rAdMSC'lerin) mitokondriyal aktivitelerinde ve alkalen fosfataz aktivitelerinde önemli bir farklılık tespit edilememiştir. SEM görüntülerinde hücrelerin biyomalzeme yüzeyine tutundukları ve mineralize nodüller oluşturduğu görüntülenmiştir. Bununla birlikte malzeme yüzeyinin tamamen hücreler ile kaplanmadığı dikkat çekmiştir. Perfüzyon biyoreaktörde farklı akış hızında (düşük hız, tek yönlü akış: 0.0476 mL/sa, ve yüksek hız, iki yönlü akış: 6 mL/sa) gerçekleştirilen çalışmalarda ise kemik dokunun daha gerçekçi bir in vitro modelinin oluşturulması amacıyla insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC'leri), kemik yıkımından sorumlu osteoklastlara farklılaşan THP-1 hücre hattı ile birlikte kültüre edilmiştir. Durgun koşullar ile karşılaştırmalı olarak yürütülen 28 günlük dinamik kokültür sonunda Alamar Mavisi, RT-PCR, SEM ve CLSM analizleri gerçekleştirilmiş, en yüksek hücre aktivitesine ve farklılaşma belirteçlerine iki yönlü akış sağlayan yüksek akış hızlı sistemde ulaşılmıştır. Perfüzyon biyoreaktörler ile gerçekleştirilen çalışmalar hücre ekim stratejisinin, ön kültür süresinin, akış hızının ve yönünün başarılı sonuçlar alabilmek için çok önemli parametreler olduğunu ortaya koymuştur. İpek fibroin doku iskeleleri çözücü dökümü parçacık uzaklaştırma yöntemi ile üretilmiş ve biyoaktivitesini arttırmak amacı ile dinamik koşullarda derişik sentetik vücut sıvısı ile muamale edilerek mineralizasyon sağlanmıştır. Mineralize ipek iskelelerde perfüzyon biyoreaktör ile gerçekleştirilen tüm kokültür çalışmalarında düşük akış hızlı sistem kullanılmıştır. Tek aşamalı hücre ekimi ve 1 günlük ön kültür yaklaşımıyla gerçekleştirilen deneylerde, hücre tutunmasındaki sorunlara bağlı olarak perfüzyon biyoreaktörün hücreleri doku iskelesinden kopardığı görülmüştür. İki aşamalı hücre ekimi ve uzun ön kültür süresi yaklaşımıyla biyomalzeme hücre etkileşiminin iyileştirilmesi hedeflenmiştir. Analizlerden elde edilen sonuçlar düşük hızlı perfüzyon kokültürün ostejenik ve osteoklastik farklılaşma üzerine olumlu etkileri olmadığını ortaya koymuştur. Tez çalışmasının son bölümünde COMSOL yazılımı kullanılarak perfüzyon biyoreaktördeki akış ve kütle aktarım simülasyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Doku iskelesi içermeyen biyoreaktörde düşük ve yüksek akış hızlı uygulamalar için geliştirilen modeller ile modelin doğruluğu test edilmiştir. Doku iskelesinin gözeneklerinde hücrelere etkiyen kayma gerilim değerlerinin hesabı için ideal gözenekli doku iskelesi modeli oluşturulmuştur. Düşük akış hızlı sistemde hücrelere etkiyen en yüksek kayma gerilimi 1.5980 x 10-4 dyne/cm2 olarak bulunurken, yüksek akış hızlı sistemde bu değer 2.0000 x 10-2 dyne/cm2'ye ulaşmıştır. Biyoreaktör ve doku iskelesi içindeki glikoz ve oksijen aktarımının simülasyonu için geçirgen doku iskelesi varsayımı ile hazırlanan modelden yararlanılmıştır. Yüksek akış hızında, iskele içindeki glikoz ve oksijen konsantrasyonları sırasıyla, 5.4907 mol/m3 ve 0.1881 mol/m3 olarak hesaplanmıştır. Düşük akış hızında ise bu değerler 1.5508 mol/m3 ve 0 mol/m3'e düşmüştür. Tez kapsamında gerçekleştirilen CFD modelleme çalışmalarından elde edilen sonuçların deneysel bulguları destekler nitelikte olduğu görülmüştür. Tüm bu sonuçlar ışığında, perfüzyon biyoreaktörde 6 mL/sa akış hızıyla osteoklast varlığında gerçekleştirilen kokültür yaklaşımının mezenkimal kök hücrelerin kitosan-HA SPHC'lerde osteojenik farklılaşmasında önemli yararlar sağladığı görülmüştür. Bununla birlikte mühendislik ürünü kemik yamalarının in vitro'da üretiminde başarılı sonuçların elde edilebilmesi için seçilen hücre kaynağının, doku iskelesinin, biyoreaktör çeşidinin ve işletim koşullarının belirleyici olduğunu sonucuna ulaşılmıştır.