Yüzey plazmon rezonans temelli trombin biyosensörünün geliştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji ve Nanotıp A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: DEMET ATAMAN SADIK
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): İSMAİL HAKKI BOYACI
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Biyosensörlerin performansını arttırmak önemli bir hedef haline gelmiştir. Biyosensörlerin hassasiyetini, seçiciliğini arttırmak için, yüzeyde oluşabilecek sterik engellemelerin ve spesifik olmayan bağlanmaların azaltılması, kararlı biyolojik tanıyıcı tabaka oluşumu ve biyolojik tanıyıcı ajanın doğru pozisyonda bağlanması ve bu arada biyolojik aktivitesinin korunması gerekmektedir. Tiyol ile modifiye edilmiş biyolojik tanıyıcı ajanların yüzeye bağlanmaları sırasında, kendiliğinden düzenlenen karışık tek tabakalar (mSAMs) ile yüzey üzerindeki yoğunluklarının azaltılması, hedef molekülü bağlama olasılıklarının arttırılması için sıklıkla kullanılan bir yöntem haline gelmiştir. Çalışma kapsamında trombin ölçümü için altın yüzey üzerinde 3,3'Dithiodipropionik asit di(N-hidroksisuccinimid ester) (DSP):6-merkapto-1-hekzanol (MCH) mSAMs oluşturularak, yüzey plazmon rezonans (YPR) temelli trombin sensörü geliştirmiştir. Yüzey immobilizasyonu gerçekleştirilirken, DSP ile birlikte kullanılan MCH ile yüzeye daha sonradan eklenecek trombin aptameri /antikorunun (biyolojik tanıyıcı ajan) yoğunluğunun azaltılması ve hedef molekülü yakalama hassasiyetinin arttırılması ve yüzeye nonspesifik ve raslantısal şekilde immobilizasyonunun ve böylece aktivitesinin azalmasının önüne geçilmesi hedeflenmiştir. Altın yüzeyin kimyasal aktivasyonu için, farklı DSP:MCH oranları (2.0:2.5, 2.0:5.0, 2.0:10.0) kullanılarak, mSAMs oluşturulmuş ve bundan sonraki aşamada DSP sayesinde trombin antikoru veya trombin aptamerinin altın yüzey üzerine bağlanması sağlanmış ve son aşamada da oluşturulan sistemin sensör özelliği denenmiştir. Yüzey üzerinde kimyasal ve biyolojik aktivasyon ve biyosensör performansının trombin ile test edilmesi, akış hücresine bağlı YPR sistemi ile gerçekleştirilmiştir. Trombin aptamer ve trombin antikor sensörlerinin artan konsantrasyonlarda trombine verdiği sensör cevabı (∆RU), kalibrasyon grafiği olarak elde edilmiştir. Trombin aptamer sensöründe doğrusal aralık, 0.0-20.0 nM ve 20.0-100.0 nM olmak üzere iki ayrı bölgede gözükmektedir. R2 değeri birinci bölge için 0,998, ikinci bölge için 0,961 olarak hesaplanmıştır. Trombin antikor sensöründe doğrusal aralığın 22.0-100.0 nM arasında olduğu gözlemlenmiştir. R2 değeri trombin antikor sensörü için 0,992 olarak hesaplanmıştır. Bu konsantrasyon aralıkları, pıhtılaşma sırasında trombinin serum içerisinde bulunabileceği konsantrasyon aralığı (1-500 nM) içerisinde bulunmaktadır. Ölçüm sınırı (limit of detection, LOD) trombin aptamer sensörü için 9.5 nM, trombin antikor sensörü için 6.0 nM olarak hesaplanmıştır. Tayin alt sınırı (limit of quantification, LOQ) ise trombin aptamer sensörü için 30.0 nM, trombin antikor sensörü için 22.0 nM olarak hesaplanmıştır. Geliştiren her iki sensör de trombin eklenmiş gerçek serum örnekleri ile denenmiş ve trombin eklenmiş PBS örnekleri ile karşılaştırılmıştır. Trombin aptamer sensöründe, trombin eklenmiş serum örneklerinden alınan ∆RU'nun, trombin eklenmiş PBS örneklerinden alınan ∆RU' ya göre iki katı daha fazla olduğu görülmüştür. Trombin antikor sensöründe ise, trombin eklenmiş serum örneklerinden alınan ∆RU'nun ve trombin eklenmiş PBS örneklerinden alınan ∆RU'nun, birbirine yakın sonuçlar verdiği görülmüştür. Bu sonuçtan yola çıkarak, DSP:MCH (2.0:2.5) arayüzeyi ile hazırlanan biyosensör sisteminde, biyolojik tanıyıcı ajan olarak antikor kullanılımının kompleks serum matriksinde trombin ölçümü için daha doğru bir tercih olduğu düşünülmektedir. Her iki sensörün de birden fazla kullanılabilme (rejenerasyon) özelliği test edilmiştir. Trombin aptamer sensöründe, trombin aptamerinin, trombini yakalaması sonucundaki ∆RU beş devir boyunca sabit kalmış, beşinci devirden sonra ∆RU'da azalma görülmüştür. Trombin antikor sensörünün rejenere edilemediği görülmüştür. Altın yüzey üzerinde 2mM DSP ve 20 mM MCH ile oluşturulan kendiliğinden düzenlenen tek tabakalar (SAMs), DSP:MCH (2.0:2.5) ve DSP:MCH (2.0:10.0) oranlarıyla oluşturulan mSAMs, X-ray fotoelektron spektroskopi (XPS) ve attenuated total reflectance-fourier dönüşümlü infrared spektroskopi (ATR-FTIR) ile karakterize edilmiştir. Altın yüzey, DSP:MCH (2.0:2.5) molar oranıyla modifiye ve BSA bağlanmış DSP:MCH (2.0:2.5) modifiye altın yüzeylerin morfolojileri, tapping mod atomik kuvvet mikroskop (AFM) ile incelenmiştir. Yüzeylerin pürüzlülük dereceleri karşılaştırılmıştır. Altın yüzeyin yüzey pürüzlülük değeri, 1.20 nm olarak hesaplanmıştır. DSP:MCH (2.0:2.5) mSAMs ile modifikasyon sonrasında, ortalama yüzey pürüzlülük değerinin 1.20 nm'den 2.20 nm'ye yükseldiği ve BSA bağlanması sonrasında 1.81 nm'ye düştüğü görülmüştür. Tez çalışmasının sonucunda, DSP:MCH arayüzeyinin biyolojik tanıyıcı ajanların bağlanması ve biyosensör geliştirilmesi için yeni bir immobilizasyon platformu olarak kullanılabileceği gösterilmiştir.