Production of recombinant antibody fragments in bacteria and their development towards medical diagnosis
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: İLKAY KOÇER KULOĞLU
Danışman: Eda Çelik Akdur
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Antikorlar ve antikor türevleri, teşhis ve tedavi edici uygulamalar ile biyoteknolojik araştırmalarda geniş bir kullanım alanına sahiptir. Bu alanlardaki uygulamaları yüksek verimle üretimlerini gerektirmesinden dolayı, antikorların küresel pazarda artan taleplerini karşılamak ve üretim maliyetlerini azaltmak için rekombinant protein teknolojisi kullanılmaktadır. En yaygın olarak kullanılan rekombinant antikor fragmanlarından biri olan tek zincirli değişken fragman (scFv), ağır ve hafif değişken bölgelerin esnek bir bağlayıcı peptit ile bağlanmasıyla oluşturulur. Scfv yapılarının özellikleri, değişken bölgelerin bağlanma sırası ile bağlayıcı peptitlerin içeriğine, uzunluğuna ve esnekliğine bağlı olarak değişmektedir. Bu tez çalışmasında, çözünür, aktif ve doğru katlanmış scFv'lerin Escherichia coli bakterisinde üretimleri önerilmiş, bağlayıcı peptitlerin scFv'lerin diagnostik uygulamalarda immobilizasyonuna yönelik etkileri araştırılmıştır. Bu amaçla, insan epidermal büyüme reseptörü 2 (HER2)'ye karşı anti-HER2 scFv ve β-galaktosidaza karşı scFv13R4, model antikor fragmanları olarak seçilmiştir. İlk olarak, meme kanseri hastalarında normalden fazla üretilen HER2 glikoproteinini hedefleyen tam uzunluktaki antikorun scFv versiyonu, örtüşme uzantısı ile ekleme polimeraz zincir reaksiyonu (SOE-PCR) ile oluşturulmuştur. Anti-HER2 scFv, fonksiyonel üretimi için uygun hücrenin belirlenebilmesi amacıyla E. coli BL21(DE3) ve disülfid bağı oluşumu için sitoplazmasında daha fazla oksitleyici koşullara sahip E. coli SHuffle T7 Express hücrelerinin sitoplazmalarında üretilmiştir. Hücrelerin karşılaştırılması, BL21(DE3)'e karşı SHuffle T7 Express'te üretilen anti-HER scFv'nin önemli ölçüde daha yüksek çözünürlük ve dört kata kadar daha yüksek antijen bağlama aktivitesi ile sonuçlanmıştır. Bu nedenle, scFv'lerin ilerleyen çalışmalardaki üretimleri SHuffle T7 Express ile gerçekleştirilmiştir. Daha sonra anti-HER2 scFv, özellikleri açısından en uygun bağlanma sırasının belirlenebilmesi için VH-bağlayıcı-VL ve VL-bağlayıcı-VH olarak tasarlanmıştır. Çözünürlük, monomer/dimer oluşumu, bağlanma aktivitesi ve afinite özelliklerinin karşılaştırılması amacı ile SHuffle hücrelerinde üretilmiştir. Çözünür üretimleri Western blot analizi ile karakterize edilirken, anti-HER2 scFv'nin in vitro immünolojik karakterizasyonu enzim bağlı immünosorbent analizi (ELISA) ve yüzey plazmon rezonans (SPR) analizi ile yapılmıştır. Sonuç olarak, anti-HER2 scFv'nin oluşturulmasında değişken alanların bağlanma sırası ilk defa bu çalışma ile araştırılmış; anti-HER2 scFv, değişken alanların bağlanma sırasından bağımsız olarak, her iki yapıda da HER2'ye karşı yüksek bağlanma aktivitesi ve seçicilik göstermiştir. Ayrıca, indükleme sıcaklığı, indükleyici (IPTG) derişimi, indükleme süresi ve ortam bileşimi gibi biyoproses işletim koşullarının scFv üretimine etkileri de araştırılmıştır. IPTG derişiminin anti-HER2 scFv üretimini önemli ölçüde etkilemediği, indükleme sonrası 16-20 sa aralığında daha yüksek miktarda çözünür scFv üretildiği ve 30°C'den düşük sıcaklıklarda çözünür protein oranının arttığı sonucuna varılmıştır. SHuffle hücrelerinde kimyasal olarak tanımlanmış minimal ortamda da anti-HER2 scFv üretimi gözlenmiştir. Çalışmanın ikinci bölümünde, daha yüksek protein üretimi sebebiyle VL-bağlayıcı-VH yapısında anti-HER2 scFv kullanılmıştır. ScFv'ler polistiren (PS) yüzeylere immobilizasyona yönelik farklı amino asit bileşimine sahip bağlayıcılar ile yeniden tasarlanmış ve yeni scFv'lerin özellikleri incelenmiştir. İmmobilizasyonun, antijene bağlanma özelliklerinin ve HER2'nin tespit edilebilirliğinin belirlenmesi için sırasıyla direkt, indirekt ve sandviç ELISA yöntemleri uygulanmıştır. Farklı bağlayıcılara sahip scFv'lerin immobilizasyon aktivitelerinin PS plaka tipine ve scFv kaplama çözeltisinin Tween 20 içerip içermemesine bağlı olarak değiştiği gözlenmiştir. Ayrıca, bağlayıcıların başka scFv'lerde etkisini anlamak için aynı bağlayıcılar bir diğer model antikor fragmanı scFv13R4 yapısına da eklenmiş ve benzer sonuçlar elde edilmiştir. Son olarak, bağlayıcı peptitlerin anti-HER2 scFv'lerin stabilitesi ve işlevselliği üzerindeki etkilerini gözlemlemek için homoloji modelleme ve moleküler dinamik (MD) simülasyonu yöntemleri ile in silico analiz yapılmıştır. Deneysel sonuçlar ve MD simülasyonlarına dayanarak, tasarlanan bağlayıcılardan birinin immünoanaliz uygulamaları için standart bağlayıcıya uygun bir alternatif olabileceği sonucuna varılmıştır. Genel olarak, bu çalışmada oluşturulan model scFv'ler çözünebilir ve biyolojik olarak aktif üretilebilmeleri ile nM düzeyde ayrışma sabitlerine (Kd) sahip olmaları nedeniyle, immünoanalizlerde veya tanı araçlarında biyolojik tanıma elemanları olarak kullanım potansiyeline sahiptir.