Kemik doku onarımı için hidroksiapatit/peptit amfifil bazlı nanokompozit doku iskelelerinin geliştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji ve Nanotıp A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SONER ÇAKMAK
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışmanın bir bölümü, 112M442 No'lu TÜBİTAK Hızlı Destek Projesi ile desteklenmiştir. Ayrıca, tezin sahibi Soner Çakmak'ın Amerika Birleşik Devletleri'nde gerçekleştirdiği çalışmalar, Hacettepe Üniversitesi Uluslararası İşbirliği Destekleme Projesi altında 13 G 602 003 No'lu proje ile desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında, kemik ve osteokondral doku mühendisliğinde kullanılabilecek farklı içerikte biyomalzemeler tasarlanmış, üretilmiş ve bu biyomalzemelerin etkinliği in vitro hücre kültürü deneyleriyle incelenmiştir. Bu amaca yönelik olarak üretilen iki-fazlı peptit amfifil (PA)/hidroksiapatit (HA) doku iskelesiyle kemik doku mühendisliği, üç-fazlı ipek-HA/ipe k/PA doku iskelesiyle ise osteokondral doku mühendisliği çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Kemik doku mühendisliği çalışmalarında kullanılan nanofiber yapıda HA matrisler elektroeğirme yöntemiyle, arjinin-glisin-aspartik asit (RGD) taşıyan PA hidrojeller (PA-RGD) ise kendiliğinden düzenlenme yöntemiyle üretilmiştir. Fourier transform kızıl ötesi spektroskopisi (ATR-FTIR) ve X-ışını kırınımı (XRD) analizleriyle HA nanofiber matrisin kimyasal yapısı doğrulanmıştır. Bu yapının yüksek kristaliniteye sahip olduğu görülmüş, ayrıca içeriğinde bulunan CaCO3 nedeniyle saf HA'ya göre daha biyobozunur bir malzeme olabileceği düşünülmektedir. Taramalı ve geçirimli elektron mikroskobu (SEM ve TEM) analizleriyle HA nanofiberlerin 437 ± 64 nm çapa sahip oldukları görülmüştür. PA-RGD hidrojellerin kendiliğinden düzenlenme ve jelleşme sonrası hücre dışı matris (ECM) yapısına benzer nanofiber düzenlenme gösterdiği AFM analiziyle gösterilmiştir. Peptit nanofiberlerin ortalama çapı, SEM görüntüleri üzerinden 100 ± 64 nm olarak hesaplanmıştır. Dairesel dikroizm ve ATR-FTIR analizleriyle, nanofiber düzenlenmenin β-tabaka ikincil yapı üzerinden gerçekleştiği ve biyoaktif sekans olan RGD'nin fiber yüzeyinde yerleştiği bulunmuştur. İn vitro çalışmalarda, kemik öncülü MC3T3-E1 hücreleri PA-RGD jeller içerisine enkapsüle edildikten sonra HA nanofiber matris bu jel içerisine yerleştirilerek nanokompozit yapı oluşturulmuştur. Hücre proliferasyonu analiziyle, HA, PA-RGD ve PA-RGD/HA doku iskelelerinin üçünde de 7. günden sonra hücre proliferasyonunun arttığı görülmüş ve 18. günde en yüksek proliferasyonun PA-RGD jelde olduğu bulunmuştur. Floresan mikroskobu ve SEM analizleriyle, hücrelerin her üç doku iskelesinde de osteoblastik morfoloji gösterdikleri tespit edilmiştir. Alkalin fosfataz (ALP) aktivitesi analiz sonucuna göre, yapıya HA eklenmesiyle çok daha etkin bir osteojenik farklılaşma gerçekleştiği sonucuna varılmıştır. Gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yöntemiyle bu malzemelerde bulunan hücrelerin erken dönem gen olan Alp ve geç dönem genler olan osteokalsin (Ocn) ve kemik sialoprotein (Bsp) ekspresyonları incelenmiştir. Alp ve Ocn ekspresyon seviyeleri bakımından kültür boyunca örnekler arasında bir fark görülmemekle birlikte, 18. gündeki Bsp ekspresyon seviyesinin PA-RGD/HA nanokompozit yapıda çok daha yüksek olması bu yapının osteojenik farklılaşmanın en önemli belirteci olan kemik mineralizasyonunu diğer örneklere göre çok daha fazla desteklediğini göstermiştir. Tüm bu sonuçlar birlikte değerlendirildiğinde, PA-RGD/HA nanokompozit doku iskelesinin kemik doku mühendisliği uygulamalarında başarılı bir şekilde kullanılabileceği görülmüştür. Tezin ikinci kısmı olan osteokondral doku mühendisliği çalışmasında ise kemik kısmı %6'lık (w/v) ipek doku iskelesinden, kıkırdak kısmı arjinin-glisin-aspartik asit-serin (RGDS) içeren PA hidrojelden (PA-RGDS) ve kemik-kıkırdak ara yüzeyi olarak ise %4'lük (w/v) ipekten oluşan üç-fazlı doku iskelesi tasarlanmıştır. Bu çalışmada ayrıca, kemik kısmı için insan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler (hBMSC) ve kıkırdak kısmı içinse insan kondrositleri (hAC) kullanılmış ve ikili kültür ortamında bu hücrelerin birbirlerine olan tropik etkileri incelenmiştir. %6'lık (w/v) ve %4'lük (w/v) ipek doku iskelelerinin gözenek çapları sırasıyla 416 ± 87 ve 194 ± 67 µm olarak hesaplanmış ve biyouyumlulukları ve içsel bağlantılı gözenekleriyle kemik ve ara yüzey için uygun yapılar olduğu görülmüştür. hBMSC'ler ipek doku iskelesi içerisinde osteojenik ortamda ve kondrositler PA-RGDS hidrojel içerisinde kondrojenik ortamda iki hafta boyunca kültüre edilmiş ve daha sonra bu iki yapı aralarına %4'lük ipek iskele eklenerek birleştirilmiş ve osteokondral kokteyl ortamında iki hafta daha kültüre edilmiştir. İkili kültür ortamındaki kondrositlerin hBMSC'lere tropik etkisi, yüksek ALP aktivitesi ve runt-ilişkili transkripsiyon faktörü (RUNX2), ALP, tip I kollajen (COLL I), BSP, osteopontin (OPN), OCN ekspresyon seviyeleriyle ve kalsiyum içeriğiyle kendini göstermiştir. SOX9, agregan (AGC) ve tip II kollajen (COLL II) ekspresyon seviyelerine bakıldığında, PA-RGDS hidrojellerde kondrojenik farklılaşmanın pellet kültüre göre çok daha erken bir sürede gerçekleştiği fakat 7.günden sonra gen ekspresyonlarının pellet kültürle benzer olduğu görülmüştür. İkili kültür kondrositler üzerinde herhangi bir tropik etki yaratmamış ve bu da kondrositlerin farklılaşmasında TGF-β1'in ikili kültüre göre çok daha etkin olduğunu göstermiştir. Histolojik boyamalar sonucunda ikili kültürde bulunan hBMSC'lerin doku iskelesi gözeneklerini çok daha yoğun bir şekilde doldurduğu görülmüş ve Alizarin kırmızısı ve von Kossa boyamalarında ikili kültürdeki hBMSC'lerin çok daha fazla ve yoğun mineralize yapılar ürettiği belirlenmiştir. Ayrıca, ikili kültürde bulunan kondrositlerin PA-RGDS hidrojeller içerisinde yoğun bir kıkırdak ECM'si ürettikleri de Alcian mavisi boyamalarıyla gösterilmiştir. Elde edilen veriler, hBMSC'lerin pahalı büyüme faktörleri kullanılmadan ikili kültür yöntemleriyle de çok etkin bir kemik yapı oluşturabileceğini ve ayrıca kondrositlerin TGF-β1 yokluğunda bile kıkırdak matrisi üretebildiğini göstermiştir. Neticede, bu çalışmada tasarlanan üç-fazlı doku iskelesinin, osteokondral doku hasarlarının tedavisi için klinikte kullanılabilir bir malzeme olduğu sonucuna varılmıştır.