Yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi kullanılarak yüksek hassasiyette DNA analizine yönelik dönen çember amplifikasyonu yönteminin geliştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Gıda Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: BURCU GÜVEN
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): İSMAİL HAKKI BOYACI
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma kapsamında; hızlı, hassas ve seçici genetiği değiştirilmiş organizma (GDO) analizini sağlamak amacıyla polimeraz zincir reaksiyonuna (PZR) alternatif bir yöntem olan dönen çember amplifikasyonu (DÇA) ile yüzeyde güçlendirilmiş Raman spektroskopisi (YGRS) temelli yeni bir sandviç yöntemi geliştirilmiş ve elde edilen sonuçlar geleneksel (DÇA uygulanmayan) YGRS sandviç yöntemiyle kıyaslanmıştır. Bu bağlamda, altın (Au) yüzey, Au kaplı manyetik nanoküre ve Au nanoçubuk partiküllerden yararlanılmıştır. Öncelikle Au kaplı manyetik nanoküre ve Au nanoçubuk partiküller sentezlenmiş, gerekli karakterizasyon ölçümleri yapılmıştır. Nanopartiküllerin üretim ve karakterizasyon aşamalarının ardından yüzey modifikasyonu, immobilizasyon, hibridizasyon, seçici olmayan bağlanmaların engellenmesi, yıkama aşamaları, güçlendirme faktörlerinin belirlenmesi gibi her bir parametre optimize edilmiştir. Diğer taraftan DÇA reaksiyonuna yönelik çalışmalar yapılmıştır. İlk olarak lineer DÇA şablonunun T4 DNA ligaz ve Circligaz II ss-DNA ligaz enzimleri ile sirküler forma dönüştürülmesi üzerine çalışılmıştır. Fakat yetersiz enzim aktivitesi nedeniyle hedeflenen DÇA şablonu bandı jel elektroforezinde gösterilememiştir. Bu nedenle sirküler DÇA şablonu ticari olarak satın alınmıştır. Sirküler DÇA şablonunun eldesinin ardından DÇA reaksiyonunu tamamlamak için primer prob dizilimi, φ29 DNA polimeraz enzimi, DÇA şablonu ve dNTP konsantrasyonu ve etkileşim süreleri optimize edilmiştir. Nanopartikül yüzey modifikasyonları ve DÇA optimizasyon çalışmalarının ardından hedef dizilime (35S promotör) özgü olan oligonükleotit probu Au yüzey üzerine immobilize edilmiş ve DÇA reaksiyonu gerçekleştirilmiştir. Au nanoçubuklar üzerinde 5,5'-dithiobis(2-nitrobenzoik asit) (DTNB) kullanılarak yüzeyde tekli tabaka oluşturulmuş ve 35S DNA promotörünün ikinci probu aktive edilmiş Au yüzey üzerine immobilize edilmiştir. Bu sayede, nanopartikül ve yüzey üzerindeki problar hedef dizilim ile hibridize edilmiştir. Hedef dizilim konsantrasyonlarının miktar tayini Au nanoçubuklar üzerindeki DTNB'nin YGRS spektrumları ile yapılmıştır. Hedef dizilimin YGRS spekturumu DÇA reaksiyonu ile güçlendirilmiş ve tayin limiti 6,3 fM olarak bulunmuştur. Geliştirilen DÇA-YGRS metodunun hassasiyeti geleneksel yöntem ile kıyaslanmış ve geleneksel yöntemin tayin limiti 0,1 pM olarak bulunmuştur. Hedef dizilim konsantrasyonu ile YGRS sinyalinin doğrusal olduğu aralık geleneksel yöntemde; 1 pM-10 nM ve DÇA-YGRS yönteminde 100 fM-100 nM olarak bulunmuştur. Ayrıca Bt-176 mısır geninin 35S bölgesi PZR ile çoğaltılarak, geliştirilen DÇA-YGRS yönteminin gerçek sistemlerdeki etkinliği incelenmiştir. Geliştirilen DÇA-YGRS sandviç yönteminin model ve gerçek sistemlerde oldukça hassas, seçici ve hedef dizilim için özgün olduğu gösterilmiştir.