Sferoid yüklü ECM--mimetik peptit amfifil hidrojellerle çip-üstü-karaciğer geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2018
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ŞEYMA BEKTAŞ
Danışman: Menemşe Gümüşderelioğlu
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma, "İlaçların Toksisitesini Belirlemede Kullanılacak Karaciğer Çipinin Geliştirilmesi" başlıklı (proje numarası FBA-2017-12820) proje kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Koordinasyon Birimi tarafından ve Türkiye Bilimsel ve Teknolojik Araştırma Kurumu (TÜBİTAK) 2210-C Öncelikli Alanlara Yönelik Yurt İçi Yüksek Lisans Burs Programı kapsamında maddi olarak desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında amaç karaciğerin görevlerini etkin olarak gerçekleştirebilecek, ilaç tarama ve toksisite testlerinde kullanılmak için "çip-üstü-karaciğer" sistemi geliştirmektir. Tezin ilk aşamasında karaciğerin fonksiyonel açıdan en küçük biriminde yer alan hepatosit (HepG2 hücre hattı) ve endotel hücrelerinden (HUVEC hücre hattı) asılı damlacık yöntemi ile sferoid üretimi gerçekleştirilmiştir. Hepatositlerin endotel hücrelerle 2:1 oranında birleştirildiği 1500 hücre içeren sferoidlerin 5 günlük inkübasyon sonunda 428±45 µm çapa sahip olduğu görülmüş ve tez kapsamında çalışmalara bu sferoidler ile devam edilmiştir. Sferoidlerin Taramalı Elektron Mikroskop (SEM) görüntülerinde yer alan kürenin dış yüzeyindeki 2-3 µm çapındaki porlar karaciğerdeki safra kanalcıkları (1-3 µm) ile benzer özelliktedir. Sferoidlerdeki hücrelerin işlevselliğini incelemek amacı ile yapılan immünositokimyasal boyama sonucu hepatositlerin, karaciğerin spesifik fonksiyonu olan albumin sentezi ve ilaç dönüşümü işlevlerini devam ettirdiği görülmüştür. Sferoidlerdeki HepG2 ve HUVEC hücre organizasyonunu ve damarlanmayı incelemek için von Willebrand Faktör boyaması yapılmış ve konfokal görüntülerinde HUVEC hücrelerinin HepG2 hücrelerini çevrelediği ve dış yüzeyden merkeze doğru 35 µm'lik tübüler yapılar oluşturduğu görülmüştür. Konfokal görüntüleri HepG2 ile HUVEC arasındaki kendiliğinden düzenlenme ve hücre sıralanma prosesinin gerçekleştiğini kanıtlamıştır. Yapılan analizler sonucunda sferoidlerin damarlı yapıda ve işlevsel olduğu bulunmuştur. Tezin ikinci aşamasında sferoidlere hücresel davranışları destekleyen yapay mikroçevrelerin oluşturulması için kolajen-mimetik (PA-GFOGER) ve fibronektin-mimetik (PA-RGDS) peptit amfifiller kullanılmıştır. PA-RGDS negatif yüke (-1), PA-GFOGER ise pozitif yüke (+4) sahip olduğu için 4:1 oranında karıştırılarak ECM-mimetik (PA-GFOGER+RGDS) hidrojel elde edilmiştir. Kalsiyum eklenmesi sonrası nanofiber düzenlemenin β-tabaka ikincil yapı üzerinden gerçekleştiği bulunmuştur. PA-GFOGER ve PA-GFOGER+RGDS hidrojellerin kendiliğinden düzenlenme ve jelleşme sonrasında birleşerek 75-100 nm çapa sahip fiber demetlerini oluşturduğu görülmüştür. Ayrıca PA-GFOGER+RGDS hidrojeli, ECM bileşenlerinin hiyerarşik organizasyonunu sağlamıştır. Reoloji analizi sonucunda tüm hidrojellerin viskoelastik karakterde olduğu ve depo modülünün kolajen katkılaması ile düştüğü gözlenmiştir. Tezin son aşamasında şırınga pompası, kültür ortam rezervuarı, polidimetilsiloksan (PDMS) çip ve bağlantı elemanlarından oluşan bir "çip-üstü-karaciğer" sistemi oluşturulmuştur. Hidrojel ile enkapsüle edilen sferoidlerin durgun ve dinamik koşullardaki kültürü hidrojelsiz sferoidlerle karşılaştırmalı olarak gen ifadesi, albumin ve üre salımı açısından değerlendirilmiştir. Sferoidler dinamik kültür koşulları altında 7 günün sonunda 2,023±409 ng albumin ve 31,003±3595 nmol üre; durgun koşullar altında ise 1,444±92 ng albumin ve 1,279±40 nmol üre salımı gerçekleştirmiştir. Özellikle hidrojel ile enkapsüle edilen sferoidlerin dinamik kültür ALBUMİN ve CYP 2E1 gen ifadeleri sırasıyla 4 ve 28,343 kat artış göstererek anlamlı düzeyde fark oluşturmuştur. Tüm bu sonuçlar ışığında perfüzyon biyoreaktörde 5 µL/dk akış hızıyla gerçekleşen dinamik kültürün sferoid performansını arttırdığını ve çip üstü organ sistemlerinde hidrojel kullanımının hücre canlılığı ve işlevselliği açısından daha iyi sonuç verdiğini ortaya koymaktadır. Bununla birlikte bu tez kapsamında geliştirilen çip üstü organ sistemi ile daha ileri uygulamalar gerçekleştirilebilmek için işletim koşullarının optimize edilmesi gerektiği sonucuna ulaşılmıştır.