HT-29 ve Caco-2 hücrelerinde hiperisin ile fotoaktivasyona bağlı değişikliklerin moleküler, akış sitometrisi, immünfloresan ve spektrofotometrik yöntemler ile araştırılması
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2012
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: AYSUN KILIÇ
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): GÜLDENİZ SELMANOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Fotodinamik tedavi (PDT), özgül olarak kanserli hücrede biriken ışık duyarlı maddenin (IDM) belirli bir dalga boyundaki ışıkla uyarıldığı alternatif bir tedavi şeklidir. PDT sonucunda oluşan reaktif oksijen türleri (ROS) hücreiçi organellere hasar vererek kanser hücrelerini apoptotik ve/veya nekrotik hücre ölümüne götürmektedir. Hiperisin, Hypericum perforatum bitkisinde doğal olarak oluşan bir IDM'dir. Hiperisin antidepresif, antiviral, antineoplastik ve antitümör etkileri nedeniyle fototeşhiste ve fototedavide kullanılmaya aday olan önemli bir etken maddedir. Hiperisin ışık ile uyarıldığında 600 nm'de floresan ışıma yapmakta ve birçok kanser tipinde hücrede seçici olarak birikmektedir.Son yıllarda, kanser hücresinin yayılımını kolaylaştıran bir anti-adezyon molekülü olan disaderin bulunmuştur. Birçok kanser hücresinin yüzeyinde yer alan bir zar glikoproteini olan disaderin, hücre içinde hücre iskeleti elemanlarıyla bağlantı yapmaktadır. Bu nedenle disaderin tümör metastazı, hücre hareketliliği ve aktin filamentinin organizasyonu ile ilişkilidir.Bu çalışmada HT-29 (derece-1) ve Caco-2 (derece-2) insan kolon adenokarsinom hücreleri, yapılan ön çalışmalara göre belirlenen 0,04 µM, 0,08 µM ve 0,15 µM hiperisin ile inkübe edilmiştir. Uygulamadan 24 saat sonra beyaz floresan lambalarla ışıma yapılmıştır. Aktivasyondan 16 ve 24 saat sonra hiperisinin hücre canlılığına etkisi tripan mavisiyle boyanarak ve MTT testi ile; metabolik aktivite glukoz, laktat miktarlarının ve laktat dehidrogenaz (LDH) aktivitesinin ölçülmesi ile; hücredeki ölüm tipi akridin oranj/propidyum iyodür (AO/PI) ve DAPI boyaması ile; morfolojik değişiklikler Giemsa boyaması ile tespit edilmiştir. Disaderin ve filamentöz aktin (F-aktin) proteinleri immünfloresan (IF) boyama ile floresan ataşmanlı inverted mikroskopta görüntülenmiştir. Ayrıca disaderinin RNA düzeyinde ifadesi reverse transkriptaz polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PZR) ile incelenmiştir. Hiperisinin hücre içine alımı ve hücre döngüsündeki değişiklikler akış sitometri analizleriyle tespit edilmiştir.Çalışmadan elde edilen sonuçlara göre, HT-29 ve Caco-2 hücreleri için hiperisin konsantrasyonundaki artışa bağlı olarak hiperisinin sitotoksik etkisi artmış, farklı oranlarda apoptotik ve nekrotik hücre ölümü gözlenmiştir. AO/PI boyamalarına göre, HT-29 hücrelerinde aktivasyondan 24 saat, Caco-2 hücrelerinde ise 16 saat sonra apoptotik hücre ölümü en fazla 0,08 µM hiperisin grubunda, nekrotik hücre ölümü ise 0,15 µM hiperisin grubunda görülmüştür. Her iki hücrede hiperisin konsantrasyonundaki artışla glukoz tüketimi ve laktat üretimi azalırken, LDH aktivitesi artmıştır. Disaderinin IF boyamasının her iki hücrede özellikle 0,15 µM hiperisin uygulamasından sonra azalması, RNA düzeyindeki azalmayla uyumlu bulunmuştur. Ayrıca F-aktin'in immünfloresan boyamalarına göre, hiperisin konsantrasyonundaki artışla hücreiçi aktin stres fibrilleri azalırken, aktin agregatları artmıştır. Akış sitometri sonuçlarına göre özellikle 0,08 µM hiperisin uygulaması, HT-29 ve Caco-2 hücrelerinde hücre döngüsünün G2/M fazında durmasına neden olmuştur.