Kemik doku mühendisliği yaklaşımında melatoninin rolü: İn vitro çalışmalar
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya Mühendisliği A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: DAMLA ÇETİN ALTINDAL
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sunulan tez çalışmasında, melatoninin osteoindüktif ve antikanserojenik özelliklerinin bir arada bulunduğu doku iskelesi-temelli bir sistem geliştirilmesi amaçlanmıştır. Melatoninin osteoindüktif etkileri preosteoblastik MC3T3-E1 hücre hattı ve insan mezenkimal kök hücreleri (hMSC); antikanserojenik etkileri ise MG-63 insan osteosarkom hücre hattı kullanılarak yürütülen in vitro hücre kültür çalışmaları ile incelenmiştir. Emülsiyon oluşturma/çözücü buharlaştırma yöntemiyle üretilen poli(laktik-ko-glikolik asit) (PLGA) nanopartiküllerin ve PLGA mikropartiküllerin sırasıyla, yaklaşık 200 nm ve 3 µm çapa sahip olduğu belirlenmiştir. İn vitro salım çalışmaları sonucunda, PLGA nano/mikropartiküllerin melatoninin kontrollü ve uzun dönemli salımı için oldukça uygun sistemler olduğu ve 40 gün sonunda partiküllerden salınan melatonin konsantrasyonunun mikromolar mertebede olduğu görülmüştür. Partiküllerden melatonin salımının Higuchi salım modeline uyduğu, dolayısıyla difüzyon mekanizmasıyla gerçekleştiği kanıtlanmıştır. PLGA nanopartiküllerin preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri ve MG-63 insan osteosarkom hücreleri üzerinde toksik etki gösterdiği belirlenmiş ve partiküllerin hücre içerisine alım yüzdeleri, sırasıyla ~%30 ve ~%60 olarak hesaplanmıştır. Dolayısıyla, PLGA nanopartiküllerin doku iskelelerine yüklenerek kullanılması gerektiği vurgulanmıştır. Kitosanın biyoaktivitesini arttırmak amacıyla toz ve boncuk formdaki hidroksiapatit (HAp) partiküllerin kitosan yapısına katılmasıyla dondurarak-kurutma yöntemi ile kitosan/hidroksiapatit (HAp) doku iskeleleri üretilmiştir. İskelelerin üç boyutlu gözenek yapıları taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve mikro-bilgisayarlı tomografi (µ-CT) ile incelenmiştir. MC3T3-E1 hücreleri ile gerçekleştirilen çalışmalarda kitosan/boncuk HAp doku iskelesinin hücre üremesini daha çok desteklediği belirlenmiştir. Melatonin yüklü PLGA mikropartiküllerin kitosan/HAp doku iskelelerinin yapısına üretim sırasında katılmasıyla hazırlanan kitosan/HAp+Mp doku iskelelerinde üreyen MC3T3-E1 hücrelerinin alkalen fosfataz (ALP) aktivitesinin ve runt-ilişkili transkripsiyon faktör (RunX2), kollajen tip 1 (Col1), osteokalsin (Ocn) ve osteopontin (Opn) genlerinin ekspresyon seviyelerinin diğer gruplara göre daha yüksek olduğu belirlenmiştir. SEM ve konfokal lazer taramalı mikroskop (CLSM) görüntüleri, hücrelerin iskelenin 600-700 µM derinliklerine kadar göç ettiklerini göstermiştir. Melatoninin osteosarkom hücreleri üzerindeki etkisini incelemek amacıyla, 900 W, 60 s ve 90 s mikrodalga koşullarında melatonin/hidroksipropil-β-siklodekstrin (HPβCD) inklüzyon kompleksleri üretilmiştir. Melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksleri, kitosan/HAp+Mp doku iskelelerine, iskele başına 2.267 ± 0.236 mg melatonin içerecek şekilde başarılı bir şekilde yüklenmiştir. İn vitro salım çalışmaları, doku iskelelerinden melatonin salımının 5 gün gibi oldukça kısa sürede gerçekleştiğini ve salınan melatoninin yaklaşık 8 mM konsantrasyonda olduğunu ortaya koymuştur. Hazırlanan melatonin/HPβCD inklüzyon kompleksi yüklü doku iskelelerinin MG-63 insan osteosarkom hücreleri üzerindeki etkisi in vitro hücre kültür çalışmaları ile incelenmiş ve bu sistemden yüksek miktarda ve çok hızlı bir şekilde salınan melatoninin kanser hücrelerinin üremesini hücre döngüsünün G0/G1 fazında inhibe ettiği belirlenmiştir. Melatoninin hMSClerin osteoblastlara farklılaşmasındaki etkisini incelemek amacıyla ipek filmler kullanılmış ve bu filmlerin yüzeyi farklı konsantrasyonlarda (0-2,000 µM) melatonin ile modifiye edilmiştir. İpek filmlerden ilk 24 saatte melatoninin büyük bir kısmı ani bir şekilde salınmış ve salım 5 gün boyunca devam etmiştir. Melatoninin 250 µM, 500 µM ve 1,000 µM konsantrasyonları hücreler üzerinde herhangi bir toksik etki yaratmadığından bu konsantrasyonlar kullanlarak hMSCler ile in vitro hücre kültür çalışmaları yürütülmüştür. Hem büyüme hem de farklılaşma ortamında gerçekleştirilen çalışmalar sonucunda, melatonin varlığının hücrelerin ALP aktiviteleri ve sırasıyla, erken ve geç dönem farklılaşma belirteçleri olan RUNX2 ve OCN protein ekspresyonlarını arttırdığı görülmüştür. Von Kossa boyamaları sonucunda, melatonin içeren ipek filmler üzerinde kültüre edilen hücrelerin kültürün geç dönemlerinde mineralize nodüller sentezledikleri belirlenmiştir. Elde edilen veriler sonucunda, geliştirilen doku iskelesi-temelli melatonin taşıyıcı sistemden salınan mikromolar konsantrasyondaki melatoninin preosteoblast hücrelerinin proliferasyonunu arttırdığı, milimolar konsantrasyondaki melatoninin ise osteosarkom hücrelerinin üremesini inhibe ettiği belirlenmiştir. Böylece, melatoninin osteoindüktif ve antikanserojenik özelliklerinin bir arada etkili olduğu bu sistemin osteosarkom tedavisi için uygun olduğu sonucuna ulaşılmıştır.