NOG GEN İFADESİ SUSTURULMUŞ HÜCRELERİN OLUŞTURULMASI VE İPEK DOKU İSKELELERİ ÜZERİNDE OSTEOJENİK FARKLILAŞMALARININ İNCELENMESİ
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2020
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SÜMEYRA NUR FUERKAITI
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): Menemşe Gümüşderelioğlu
Eş Danışman: Anıl Sera Çakmak
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Bu çalışma "CRISPR/Cas9 ile Nog Gen İfadesi Susturulmuş Hücrelerin Oluşturulması ve İpek Doku İskeleleri Üzerinde Osteojenik Farklılaşmalarının İncelenmesi" başlıklı Lisansüstü Tez Projesi (FYL-2018-17253) kapsamında Hacettepe Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Koordinasyon Birimi tarafından desteklenmiştir. Sunulan tez çalışmasında, öncelikle moleküler gen düzenleme mekanizmaları kullanılarak (CRISPR-Cas9, siRNA), kemik morfogenetik proteini (BMP) sinyal yolağının antagonisti olan Noggin protein sentezinin inhibe edilmesiyle preosteoblastik MC3T3-E1 hücreleri üzerinde moleküler düzenlenmenin gerçekleştirilmesi amaçlanmıştır. Ardından bu hücreler ile üç boyutlu (3B) ipek doku iskelelerinde osteojenik farklılaşmanın arttırılması hedeflenmiştir. Bu hedeflere yönelik olarak, sunulan tez çalışması 4 basamakta gerçekleştirilmiştir. İlk basamakta, Bombyx mori ipek kozalarından ipek çözeltisi elde edilmiş ve çözücü döküm partikül uzaklaştırma yöntemi kullanılarak ipek doku iskeleleri üretilmiştir. SEM görüntüleri ile doku iskelelerinin içsel bağlantılara sahip gözenekli bir yapı sergiledikleri belirlenmiş ve gözeneklilik %93.5 olarak hesaplanmıştır. Büyük gözeneklerin ortalama çapı 448±76 μm, küçük gözeneklerin ortalama çapı ise 85±27 μm olarak bulunmuştur. İpek doku iskelesinin yaklaşık 5. dk'da %1300 değerinde denge su tutma kapasitesine ulaştığı belirlenmiştir. Tez çalışmasının ikinci basamağında, MC3T3-E1 hücreleri üzerinde UltraCruz® ve Lipofektamin®3000 transfeksiyon ajanları kullanılarak kontrol CRISPR plazmidinin transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Ancak, kullanılan transfeksiyon ajanlarının etkin transfeksiyon için yeterli olmadığı saptanmıştır. Etkin transfeksiyonun sağlanabileceği elektroporasyon veya virüs bazlı transfeksiyon metotlarının kullanılması için laboratuvar koşullarımızın yeterli olmaması nedeniyle transfeksiyon çalışmalarına siRNA ile devam edilmiştir. Üçüncü basamakta, siNog ile MC3T3-E1 hücreleri üzerinde transfeksiyon çalışmaları gerçekleştirilmiştir. Öncelikle kırmızı floresan işaretli kontrol siRNA/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon koşulları belirlenmiştir. Sonrasında, iki boyutlu ortamda (2B) MC3T3-E1 hücreleri üzerinde siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Gerçek Zamanlı Polimeraz Zincir Reaksiyonu (RT-PCR) analizi sonucunda, siNog grubunda Nog gen ekspresyonunun, kontrol ve negatif kontrol grubuna göre anlamlı derecede azaldığı görülmüştür (p<0.05*). Tezin son basamağında, MC3T3-E1 hücreleri 3B ipek doku iskelesi üzerine ekilmiş ve siNog/Lipofektamin®3000 ile transfeksiyon çalışması gerçekleştirilmiştir. Kültür 100 ng/mL BMP2 içeren osteojenik farklılaşma ortamıyla 21 gün devam ettirilmiştir. Sonrasında, kemik doku oluşumunu ve transfeksiyon etkinliğini incelemek amacıyla; Nog, Alp, Col1a1, Osp ve Ocn genlerinin ekspresyon düzeyleri RT-PCR ile belirlenmiştir. RT-PCR sonucunda, Nog gen ekspresyonunun siNog grubunda başarılı bir şekilde baskılandığı ve özellikle Ocn gen ifadesinin, kültürün 21. gününde siNog grubunda kontrol grubuna göre yaklaşık 5 kat arttığı belirlenmiştir (p<0.05*). Hücrelerin proliferasyon davranışları MTT (3-[4,5-Dimetilazol-2-il]-Difeniltetrazolyum Bromür) testi ile analiz edilmiş ve transfekte hücrelerin hücre yapışmasını ve proliferasyonunu olumsuz etkilemediği sonucuna ulaşılmıştır. SEM analizi ile hücre morfolojisi incelendiğinde, kontrol ve siNog gruplarında hücrelerin gözeneklerin iç kısmına kadar ulaştıkları, başarılı bir şekilde doku iskelesi üzerinde üredikleri gözlemlenmiş ve siNog gruplarında kontrol grubundan farklı olarak mineral yapılarına rastlanmıştır. EDAX analizi ile mineral yapıları incelendiğinde, siNog gruplarında hücreler üzerinde kümelenmiş yoğun Kalsiyum (Ca) ve Fosfor (P) elementlerine rastlanmıştır. Histolojik boyamalar sonucunda, siNog gruplarında yoğun mineralize bölgelerin olduğu görülmüştür. Sonuç olarak, ipek doku iskelesine ekilip siNog ile transfekte edilen MC3T3-E1 hücrelerinin kontrol grubuna göre daha etkin bir osteojenik farklılaşma gösterdiği, mineralizasyondan sorumlu olan Ocn gen ifadesinin daha yüksek seviyede olduğu ve yoğun mineralize bölgelere sahip olduğu belirlenmiştir. siNog ile transfekte edilen preosteoblastik hücrelerin 3B ipek doku iskeleleri ile birlikte kullanılmasıyla, özellikle mineralizasyonun arttırılmasına bağlı olarak kemik doku mühendisliği çalışmalarında avantaj sağlayacağı sonucuna ulaşılmıştır. Anahtar Kelimeler: İpek, siRNA, BMP2, Noggin, Kemik doku mühendisliği