Bakır tayini için yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörlerin hazırlanması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji ve Nanotıp A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: VOLKAN SAFRAN
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): NECDET SAĞLAM
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Wilson hastalığı (WH) bakırın böbrek, beyin ve korneada aşırı depolanmasıyla karakterize kalıtsal bakır metabolizma bozukluğuyla ilgili otozomal resesif bir hastalıktır. Hastalık teşhis edilmez ve semptomları giderilmezse genellikle ölümcüldür. Kanda serbest (bağlı olmayan) bakır konsantrasyonları artar ve hücrelerde oksidatif hasara neden olabilir. WH hastalığı ilk olarak 1912 yılında Kinnear Wilson tarafından siroza yol açan karaciğer hastalığının da eşlik ettiği ölümcül nörolojik hastalık olarak tanımlandı [1]. 1993 yılında ise WD'da anormal ATP7B geni tespit edildi [2]. Bu gen bakırın taşınmasından sorumlu P-tip adenozin trifosfataz (ATPaz) enzimini kodlar. ATP7B protein'in yokluğunda ya da fonksiyonlarının azalmasıyla bakırın karaciğer hücrelerinden safraya atılması azalır. Buda hepatik bakır birikmesi ve biriken bakırın nihayetinde kana karışarak özellikle beyin, böbrek ve korneada birikerek hasara sebep olması demektir. Yapılan çalışmada, Cu+2 iyonu baskılanmış SPR temelli biyosensör hazırlayarak bakır (II) iyonunun (Cu+2) sulu çözeltiden, eklenmiş izotonik çözeltisi ve sentetik idrardan tayini amaçlanmıştır. Bu hedef doğrultusunda, özellikle Moleküler baskılanmış polimerler (MIP) hazırlanması kolay, ucuz, kararlı, moleküler tanıma yeteneği olan ve ayrıca büyük miktarlarda üretilebilen ve tekrar kullanılabilen malzemelerdir. Bu yüzden, MIP'ler yapay molekül tanıyan malzemeler olarak tanımlanabilir. Adsorpsiyon temelli moleküler tanıma teknikleri hedef molekülleri için gösterdikleri yüksek seçicilikten dolayı bazı alanlarda dikkatleri üzerine çekmiştir. Biyolojik cevabı, elektriksel sinyallere dönüştüren cihazlar "Biyosensörler" olarak tanımlanırlar. Yüzey plazmon rezonans (SPR) yöntemi, biyomoleküler etkileşimlerden kaynaklanan metal yüzeye yakın kırılma indisindeki değişiklikleri ölçmede kullanılan kusursuz bir yöntemdir. SPR biyosensörlerin eş-zamanlı ölçüm yapabilme, yüksek hassasiyet ve sipesifiklik, herhangi bir işaretleyici ajana ihtiyaç duymama gibi üstün özelliklerinden dolayı son zamanlarda bir çok değişik analit türünün araştırılması uygulamalarında oldukça popüler olmuştur [3]. MIP'lar son zamanlarda SPR biyosensörlerin yüzeyinde biyotanıma yüzeyleri oluşturmak için kullanılmaktadır [4]. Sunulan çalışmada, Cu+2 iyonu baskılanmış SPR temelli biyosensör hazırlayarak bakır (II) iyonunun (Cu2+) sulu çözeltiden, spike edilmiş izotonik çözeltisi ve sentetik idrardan tayini amaçlandı. Bu amaçla öncelikle Cu+2 iyonları ile koordinasyon yapabilecek N-Metakroil-(L)-Sistein (MAC) monomeri sentezlendi. Sonrasında, MAC monomeri, kalıp molekül olarak kullanılan Cu2+ iyonu ile etkileştirilerek MAC-Cu2+ ön-kompleksi hazırlandı. Optimum kalıp molekül Cu2+ iyonu, MAC monomer oranı Cu2+ iyonunun farklı oranlarda MAC monomeri ile karıştırılarak UV-görünür bölge spektrofotometre kullanılmasıyla tespit edildi. Daha sonra hazırlanan MAC-Cu2+ ön-kompleksi 2-hidroksietil metakrilat (HEMA) ve çapraz bağlayıcı etilenglikol dimetakrilat (EDMA) monomerleri varlığında karıştırılarak polimerizasyon için monomer fazı hazırlandı. Polimerizasyon sonunda Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 nanopartiküller elde edildi. Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 nanopartiküller iki-fazlı miniemülsiyon polimerizasyon yöntemi ile hazırlandı. Faz I; PVA (100 mg), SDS (15 mg) ve NaHCO3'ın (12.5 mg) 5.0 mL deiyonize su içinde çözülmesiyle hazırlandı. Faz II; PVA (50 mg) ve SDS'in (50 mg) 100 mL deiyonize suda çözülmesiyle hazırlandı. MAC-Cu2+ ön-kompleksi (0.10; 0.05 mmol) 2-hidroksietil metakrilat (HEMA; 0.05 mmol) ve çapraz bağlayıcı etilenglikol dimetakrilat' dan (EDMA; 0.10 mmol) oluşan monomer fazında çözülerek yağ fazı elde edilmiştir. Yağ fazı faz I'e yavaşça eklenmiştir. Karışım, 25 000 rprarm de homojenizatörde homojenize edildikten sonra Faz II ile karıştırılmıştır. Sodyum bisülfit (125 mg) ve amonyum persülfat (125 mg) başlatıcılarının eklenmesinden sonra polimerizasyon işlemi 40 °C de 24 süreyle gerçekleştirilmiştir. Ayrıca kontrol deneyi için kalıp molekül olan Cu2+ iyonu kullanılmadan, baskılanmamış PHEMAC nanopartiküller SPR biyosensör için hazırlanmıştır. Hazırlanan naopartiküllerin karakterizasyonu Fourier transform- Attenuated total reflektans (FTIR-ATR) spekstroskopi, zeta boyut analizi, taramalı elektron mikroskobu (SEM) ve elementel analiz ile yapılmıştır. Hazırlanan PHEMAC-Cu2+ ve PHEMAC SPR biyosensörleri atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı (CA) ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Parçacık boyut analizi ve Cu2+ baskılanmış PHEMAC-Cu2+ nanopartiküllerin polidispersite değerinin (Pdı= 0.059) küçük olması sebebiyle boyut dağılımının oldukça homojen olduğu (46.10 nm) görüldü. Taramalı elektron mikroskobu (SEM) görüntülerinden elde edilen nanopartiküllerin farklı oranlarda büyütülmüş fotoğraflarından anlaşıldığı üzere ortalama boyut dağılımının 40-50 nm arasında olduğu görüldü. AFM görüntülerinden Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 ve baskılanmamış PHEMAC biyosensörlerin ortalama yüzey pürüzlülüğü sırasıyla 5.51 nm ve 4.33 nm olarak bulunmuştur. Cu+2 iyonu baskılanmış PHEMAC-Cu+2 ve baskılanmamış PHEMAC biyosensörlerin pürüzlülük değerlerindeki farklılık; Cu+2 iyonunun PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün yüzeyine başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir. Adsorpsiyon çalışmaları için sırasıyla 0.1 nM, 0.25 nM, 1.0 nM, 2.5 nM, 10 nM, 25 nM ve 100 nM Cu+2 iyonlarını içeren çözeltiler 10 mM pH 5.0 fosfat tamponu kullanılarak hazırlandı. Desorpsiyon çalışmaları için de metal-şelatör ajanı içeren 0.005 M etilendiamin tetraasetik asit (EDTA) ) çözelti kullanılmıştır. PHEMAC-Cu2+ ve PHEMAC SPR biyosensörlerin Cu2+ tayin seçiciliği, Ni+2 ve Zn+2 iyonlarının bulunduğu çözeltiler kullanılarak araştırılmıştır. PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensörü, PHEMAC SPR biyosensörüne göre Cu2+ 'ye karşı daha fazla seçicilik göstermiştir. Doğal kaynaktan alınan sentetilk idrar ve izotonik serum örneklerine Cu+2 iyonu spike edilmesiyle hazırlanan örneklerle de kinetik çalışmalar yapılmıştır. PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensör ile Cu2+ çözeltisi arasındaki etkileşim modelini belirlemek amacıyla Scatchard, Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) olmak üzere dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır. Langmuir adsorpsiyon modeli, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulunmuş ve sonuçlar PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensör yüzeyindeki Cu2+ bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı ve tek tabakalı olduğunu göstermiştir. PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün tekrar kullanılabilirliğini incelemek amacıyla Cu+2 iyonunu içeren çözeltiler SPR sistemine tekrarlı (4 kez) bir şekilde enjekte edilmiş reflektansları ölçülmüştür. Ölçümlerin kesinlik değerini tespit etmek için PHEMAC-Cu+2 SPR biyosensörün gün içi ve günler arası Cu+2 iyonuna karşı verdiği sinyal şiddetinin tekrarlanabilirlik çalışmaları istatiksel olarak değerlendirilmiş ve % RSD değerleri olarak verilmiştir. Kesinlik çalışmaları %RSD değerinin <1.5 olması sebebiyle metodunun tekrarlanabilir olduğunu göstermektedir. Sonuçlar, PHEMAC-Cu2+ SPR biyosensörün Cu2+ için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu göstermektedir.