Glikopeptitlerin kütle spektrometrik analizleri için yeni bir biyoanalitik yöntem geliştirilmesi ve insan C1-inhibitör proteininin ayrıntılı bölgeye özgü glikozilasyon analizinin gerçekleştirilmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2016
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HACI MEHMET KAYILI
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): BEKİR SALİH
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Post-translasyonel modifikasyonlarından en önemlileri arasında yer alan glikozilasyon, hücre içinde enzimatik reaksiyonlar sonucunda oluşmaktadır. Bu modifikasyona uğrayan proteinler, yapılarındaki değişiklik sonrasında hayati öneme sahip işlevler kazanmaktadır. Bu değişim sürecinin bozulması veya olağan dışı bir şekilde meydana gelmesi, çeşitli hücresel bozuklukların oluşmasına neden olmaktadır. Bu nedenle, glikozilasyona uğramış proteinlerin işlevlerinin tam anlamıyla aydınlatılabilmesi için yapılarının güvenilir teknikler kullanılarak karakterize edilmeleri gerekmektedir. Kütle spektrometrisi, glikozilasyon bölgelerinin tespitinde kullanılan en uygun tekniklerden birisi olmasına rağmen glikopeptitlerin kütle spektrometrik yöntemlerle karakterize edilmesi çalışmaları çeşitli zorluklar içermektedir. Glikopeptitlerin analizlerinde karşılaşılan problemlerin ortadan kaldırılması amacıyla kütle spektrometrik analiz öncesinde glikopeptitlerin karmaşık biyolojik örnekler içerisinden verimli, hızlı ve seçimli olarak zenginleştirilmeleri gerekmektedir. Bu tezin ilk aşamasında glikopeptitlerin ve glikanların sürdürülebilir kütle spektrometrik analizlerinin yapılabilmesi için titanyum temelli Poli(vinilpirolidon) (PVP) içeren hibrit bir sol-jel malzeme kalsinasyon işlemi olmaksızın kolay ve hızlı bir yöntemle sentezlendi. Sentezlenen malzemenin detaylı yapısal karakterizasyonları çeşitli yöntemlerle (FT-IR, XRD, SEM, EDX) gerçekleştirildi. Çalışmada, kütle spektrometrisi temelli hızlı glikoproteomiks uygulamaları için titanyum temelli sol-jel malzeme içeren bir pipet ucu geliştirildi. Bu pipet ucunun zenginleştirme performansı glikan düzeyinde insan plazma glikomu üzerine, glikopeptit düzeyinde insan transferrin proteini üzerine yapılan çalışmalarda belirlendi. Geliştirilen biyoanalitik yöntemin seçiciliğinin yanı sıra hassasiyetinin de çok yüksek düzeyde olduğu (femtomol düzeyinde) ticari TiO2 ile kıyaslandığında tespit edildi. Titanyum temelli glikopeptit zenginleştirme pipet ucunun tekrarlanabilirlik, kapasite ve geri kazanım testleri yapıldı. Son olarak glikopeptitlerin analizi için geliştirilen bu yeni biyoanalitik yöntemin karmaşık biyolojik örneklerdeki glikopeptit zenginleştirme performansı, bir glikoprotein karışımı ve insan plazma glikoproteomunda test edildi. Tezin ikinci kısmında, yüksek oranda glikozillenmiş insan plazma proteini ve serin proteaz inhibitörü olan C1-İnh proteininin bölgeye özgü glikozilasyon analizleri ileri kütle spektrometrik teknikler kullanılarak gerçekleştirildi. C1-İnh çeşitli proteazlar ile peptit birimlerine parçalandı ve elde edilen (gliko)peptitlerin analizi ters faz sıvı kromatofrafisi (RP) bağlı elektrosprey iyonlaşmalı iyon tuzaklı (IT) veya RP-gözenekli grafitize karbon kolonu (PGC) bağlı elektrosprey iyonlaşmalı dört kutuplu uçuş-zamanlı (QTOF) ardışık MS/MS kabiliyetine sahip kütle spektrometrileri ile gerçekleştirlidi. MS/MS parçalanma ürünleri, çarpışma ile indüklenmiş ayrıştırma (CID), çoklu-enerji CID ve elektron transferi ile gerçekleşen ayrıştırma (ETD) teknikleri ile elde edildi. C1-İnh proteini üzerine yapılan analizler C1-İnh proteininin yüksek oranda glikozillenmiş N-terminal bölgesine sahip olduğunu gösterdi. Çekirdek-1 glikan türüne sahip 9 tanesi bu çalışma ile ilk kez belirlenen 13 O-glikozilasyon bölgesi karakterize edildi. İlave olarak, 16 farklı O-glikan içeren yüksek oranda glikozillenmiş bir bölge Thr82-Ser121 peptidi üzerinde tespit edildi. Ayrıca C1-İnh proteininin bölgeye özgü glikozilasyon analizi ile altı N-glikozilasyon bölgesinden beşi (Asn25, Asn69, Asn238, Asn253 ve Asn352) belirlendi. C1-İnh proteininin N-glikanları, bağlanmaya özgü siyalik asit türevlendirme işlemi sonrasında MALDI-TOF/TOF-MS/MS ile analiz edildi. Elde edilen veriler C1-İnh proteininin özellikle O-glikozilasyon açısından çok büyük miktarda glikozillenmiş olduğunu göstermiş ve C1-İnh ait glikozilasyon bölgeleri üzerine işlevsel çalışmalar için bir temel oluşturmuştur.