Atopik dermatit hücre kültür modelinde sert suyun kallikrein-ilişkili peptidazlar ve oksidatif stres üzerine etkisinin incelenmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2023
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: ALİ DORUK UZUNKAYA
Danışman: İbrahim Çağatay Karaaslan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Atopik dermatit (AD), çocuklarda daha sık görülmekle birlikte her yaştan insanı etkileyen en yaygın inflamatuvar deri hastalığıdır. Cilt kuruluğu, kaşıntı ve kızarıklıkla karakterize olan AD, deri bariyer fonksiyon bozukluğu ve immün sistemin aşırı aktivasyonu ile tanımlanmaktadır. AD patogenezinde sıklıkla tip-2 immün cevap mekanizması gözlenmektedir. Hastalıkla ilişkili sigara ve hava kirliliği gibi etkenlerin yanı sıra, kireçli su ile karşılaşmanın da deri bariyer bütünlüğünü bozarak, AD şiddetinde etkili olduğu bulunmuştur. İçeriğindeki yüksek kalsiyum ve magnezyum iyonlarıyla, normal sulara göre daha alkalidir (pH>8.5) ve derinin fizyolojik pH seviyesinin (pH:4.5-5.3) arttırmaktadır. Derideki proteaz gruplarından olan kallikrein-ilişkili peptidazlar (KLK) sağlıklı bir deride yaşlanan derinin dökülmesinde rol oynarken yüksek pH seviyelerinde ise artan proteolitik aktiviteleri sonucunda derinin geçirgenliğinin artmasına ve alerjenlere karşı savunmasız kalmasına neden olmaktadırlar. pH değişikliğine bağlı aktivitesi artan KLK-5 ve -7'nin, deride epitel hücre yüzeyinde bulunan reseptörlerden TLR-2 veya PAR-2 aracılığıyla inflamasyona neden oldukları bulunmuştur. Hücre dışına salınan KLK'ların, anti-mikrobiyal peptit olan LL-37'yi aktifleştirirken, inflamatuvar hücrelerde ise reaktif oksijen türlerinin (ROS) artışına neden olduğu bilinmektedir. Tez çalışması kapsamında kireçli su ile gerçekleşen pH ve iyon değişiminin KLK-5 ve -7 ile LL-37 üzerindeki etkisi hem AD durumunda (AD(+)) hem de AD olmayan (AD(-)) durumdaki farklılaştırılmış keratinositlerde gen (gerçek zamanlı PZR) ve protein (ELISA) düzeyinde araştırılmıştır. Keratinositlerde, TLR-2 ve PAR-2 blokanları kullanılarak KLK'ların epitel hücrede hangi reseptör/reseptörler üzerinden etkili olduğu incelenmiştir. Yapılan keratinosit-eozinofil ko-kültür modeli ile kireçli su ile uyarılan epitel hücreden salınan KLK'ların ve LL-37'nin eozinofillerde ROT üretimindeki rolü gerçek-zamanlı PZR deneyi aracılığıyla araştırılmıştır. HaCaT hücrelerinin hem tek başına olduğu hem de Eol-1 hücre hattı ile ko-kültüre alındıktan sonra gerçekleştirilen uyarımlar sonucu HaCaT hücrelerinden üretilen KLK-5 seviyesi ELISA yöntemi ile KLK-7 ve LL-37 gen ifadeleri ise gerçek-zamanlı PZR deneyi ile tayin edilmiştir. Gerçekleştirilen ELISA ve gerçek-zamanlı PZR deneyleri sonucunda KLK-5 seviyesi 12 saat ve 24 saatlik uyarımlarda 180 ve 200 mg/L CaCO3 ile özellikle AD(-) koşullarında artış gösterirken, bu artış C29 ve SsnB blokanlarının varlığıyla tersine çevrilmiş veya engellenmiştir. Bu sonuçların yanında, KLK-5 seviyesi AD(+) koşullarda değişkenlik göstermiş, bazı koşullarda CaCO3 uyarımıyla azalırken C29 ve SsnB blokanlarının kullanıldığı her iki CaCO3 konsantrasyonunda da artmış tespit edilmiştir. KLK-7 ve LL-37 gen ifadeleri ise 12 saatlik AD(-) uyarım koşulunda CaCO3 ile azalmış, ancak C29 blokanı bu etkiyi tersine çevirerek gen ifadelerini önemli ölçüde artırmıştır. Buna karşılık, AD(+) koşulda, KLK-7 ifadesi 200 mg/L CaCO3 ile yükselmiş, C29 ile düşmüş, ancak SsnB ile tekrar yükselmiştir. LL-37 ifadesi ise tüm koşullarda artış göstermiştir. 24 saatlik AD(-) deney düzeneğinde, KLK-7 ifadesi tüm koşullarda artış göstermiştir. LL-37 ifadesi de CaCO3 ve C29 ile artmıştır. Bununla birlikte, AD(+) koşullarda KLK-7 ifadesi 200 mg/L CaCO3 ile 32 katlık bir artış gösterirken bu artış ortama blokanların eklenmesiyle hafiflemiştir. Eol-1 hücre hattından izole edilen RNA'lar ile yapılan ROS gen profillerinin incelendiği deneyde SOD1 ve ApoE gibi AD hastalığında biyobelirteç olarak da kullanılan genlerin ifadelerinde 180 mg/L CaCO3 ile karşılaşılması sonucu artış tespit edilirken, kalsiyum karbonatın etkisi TLR-2 reseptör blokanlarının varlığıyla tersine çevrilmiştir. Elde edilen bu sonuca rağmen SsnB blokanının varlığıyla geriye kalan oksidatif stres genlerinin ifadesi ile AD-modelden bağımsız olarak hem 12 hem de 24 saatlik uyarımlar sonucu yükselmiştir. Gerçekleştirilen tüm deneyler sonucunda 2 farklı konsantrasyonda CaCO3 ile uyarılan HaCaT hücre hattında AD durumundan bağımsız bir şekilde KLK-5, KLK-7 ve LL-37 hem gen (gerçek-zamanlı PZR) hem de protein (ELISA) seviyelerinde 12 ve 24 saatte belirli koşullarda artış gözlenmiştir. CaCO3 uyarımlarının yanı sıra TLR-2 reseptör blokanı olarak kullanılan inhibitörlerin ortamda bulunmasıyla ilgili genlerin hem ifadesinde hem de protein düzeylerinde artış tespit edilmiştir. TLR-2 reseptör blokanlarıyla elde edilen bu sonuçlar CaCO3'ün HaCaT hücreleri üzerindeki etkisinin TLR-2 reseptörü yerine başka reseptör üzerinden gidebileceği ve kullanılan reseptör blokanlarının da HaCaT hücrelerinde farklı hücresel yolakları etkileyerek KLK-5, KLK-7 ve LL-37'nin gen ve protein düzeyinde daha yüksek seyretmesine neden olabileceği gözlemlenmiştir.