Tetrasiklin tayinine yönelik aptamer bağlı peroksidaz benzeri mikropartiküllerin geliştirilmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, BİYOMÜHENDİSLİK ANABİLİM DALI, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2021
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: SENA KILIÇ
Danışman: Eda Çelik Akdur
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:İnsan güvenliğini ve sağlığını korumak için gıdalarda ve sularda biriken antibiyotik kalıntılarının tayinine yönelik hassas ve seçici yöntemlere ihtiyaç duyulmaktadır. Kullanımı yaygın olan tetrasiklinin kalıntılarının tayini için kullanılan geleneksel yöntemlerin zaman alıcı olması, profesyonel çalışma becerisi gerektirmesi ve tayin için yüksek maliyetli cihazlar kullanılması gibi dezavantajları vardır. Sunulan tez kapsamında, sulu çözeltilerde tetrasiklin antibiyotiğinin tayini için peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartikül ve aptamerden oluşan bir biyosensörün geliştirilmesi amaçlanmıştır. Çalışmada kullanılan peroksidaz benzeri aktivite gösteren manyetik mikropartiküller, son yıllarda kullanılan tetrasiklinin tayin yöntemlerine alternatif oluşturmak için geliştirilmiştir. Bu kapsamda, (3-glisidiloksipropil) trimetoksisilan (GLYMO)-bağlı manyetik silika (MagSiO2) mikropartiküller ve (3-aminopropil)trietoksisilan (APTES)-bağlı mikropartiküller sentezlenmiştir. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve GLYMO ile 110ºC'de reflux sisteminde 8 saat boyunca reaksiyona girmiştir. Mikropartiküller sırasıyla etanol, ddH2O ve sodyum karbonat (Na2CO3) ile yıkandıktan sonra etilendiamin ve Na2CO3 ile 60ºC'de t=24 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Reaksiyonun ardından mikropartiküller sırasıyla fosfat tampon çözeltisi (PB) ve ddH2O ile yıkandıktan sonra gravimetrik analiz ile partikülün yoğunluğu belirlenmiş ve mikropartiküller tekrar PB ile yıkanmıştır. APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin sentezi için APTES, MagSiO2 mikropartikülleri, tolüen ve tris-etilamin ile de benzer bir sentez yöntemi izlenmiştir. Mikropartiküllerin peroksidaz benzeri aktivitesini ölçmek için o-fenilendiamin (OPD) kullanılmıştır. GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerin, APTES-bağlı MagSiO2 mikropartiküllerden daha fazla absorbans değeri verdiği görülmüştür. Gluteraldehit çapraz bağlayacısı ile GLYMO-bağlı MagSiO2 mikropartiküller 18-24 saat süre aralığında, oda sıcaklığında ve karanlıkta reaksiyona girmiş, sonrasında partiküller PB ile yıkanmıştır. Aptamerler ise 5 dakika boyunca 95°C'de denature edildikten sonra 10 dk buzun üzerinde bekletilmiş; aptamer çözeltisi ve mikropartiküller oda sıcaklığında t=2 st boyunca reaksiyona bırakılmıştır. Aptamer tutuklanmış mikropartiküller, PB ile yıkandıktan sonra tetrasiklin çözeltisi (100-200-500-1000-2000 ng/µl) ile karanlıkta t=30 dk boyunca reaksiyona girmiştir. Partikül-aptamer-tetrasiklin PB ile yıkandıktan sonra OPD ile oda sıcaklığında ve karanlıkta, t=45-75 dk zaman aralığında reaksiyona bırakılmıştır. Farklı iyon ve derişimlere sahip tampon çözeltiler kullanılarak değişen aptamerin katlanma şeklinin ve aptamer yoğunluğunun tetrasiklin tayinine olan etkisi de incelenmiştir. OPD çözeltisi hazırlanırken pH, ortam tampon çözeltisi, çözeltinin derişimi ve H2O2 miktarının optimizasyonu yapılmıştır. Plaka okuyucuda OD=450 nm'de yapılan ölçümler sonucunda pH=7 olan fosfat sitrat tampon çözeltisi ile hazırlanmış 10 mM OPD solüsyonu kullanıldığında en yüksek ΔA değerine ulaşılmış ve t=60 dk'nın optimum reaksiyon süresi olduğu sonucuna varılmıştır. OPD'nin reaksiyonunu durdurmak için 3 M HCl kullanılmış, OD=492 nm'de yapılan ölçümler sonucunda HCl miktarı arttıkça absorbans değerinin arttığı, ancak ΔA değerinin azaldığı tespit edilmiştir. Yapılan tüm optimizasyon çalışmaları neticesinde tetrasiklin derişimi taranmış, alt tespit limiti LOD=100 ng/µl olarak bulunmuştur. Sütte izin verilen tetrasiklinin maksimum kalıntı limitleri ise Avrupa Birliği'nde 200 ng/µl'dir. Sonuç olarak bu çalışmada, tetrasiklini tayinine yönelik kullanımı kolay, düşük maliyetli, enzim benzeri özellik gösteren mikropartiküller ile aptamer-bağlı bir biyosensör geliştirilmiştir.