Mezenkimal kök hücrelerin BMP-6 geni aktarımı ile kıkırdak dokusuna farklılaşması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Nanoteknoloji ve Nanotıp A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2011
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: GONCA KARAGÖZ
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Sunulan tez çalışmasında amaç, BMP6 (Bone Morphogenetic Protein 6) geni ile modifiye edilmiş sıçan kemik iliği kökenli mezenkimal kök hücreler ve kitosan doku iskelelerinden oluşan yapının, in vitro ortamda kıkırdak doku oluşturma potansiyelinin araştırılmasıdır. Bu amaca yönelik olarak, BMP6 genini içeren pShuttle-rBMP6 plazmidi elde edilmiş, hücrelerin plazmidle modifikasyonu sağlanmış ve BMP6 ile modifiye olmuş hücrelerin kitosan doku iskeleleri üzerindeki davranışları, hücre kültür sistemlerinde araştırılmıştır.Çalışmanın ilk aşamasında, gen aktarımında kullanılacak plazmidin taşıdığı BMP6 cDNA'sının, plazmidteki varlığı ve nükleotid dizisi, dizi analiziyle doğrulandıktan sonra, plazmidin kompetent E.coli hücrelerine transformasyonu gerçekleştirilmiştir.Transforme E.coli hücreleri sıvı besi ortamlarında kültüre edilerek plazmidin bu hücrelerde çoğaltılması sağlanmış, çoğalan hücrelerden kit aracılığıyla saf halde plazmid DNA izolasyonu yapılmıştır.Çalışma kapsamında gerçekleştirilen bir diğer aşamada, kitosan ve lipid bazlı ajandan oluşan iki farklı gen aktarım sistemiyle plazmid DNA birleştirilip DNA-lipozom ve DNA-kitosan kompleksleri elde edilmiştir. Oluşturulan DNA-lipozom kompleksleri sıçan mezenkimal kök hücrelerine aktarılıp BMP6 geni ile modifiye edilmiş mezenkimal kök hücreler elde edilmiştir. Gen ile aktifleşmiş kitosan ise dondurarak-kurutma yöntemiyle üretilmiş kitosan doku iskelelerine (çap=5 mm, kalınlık=1 mm), fosfat tampon çözeltisi içinde çözünmüş plazmid DNA emdirilerek hazırlanmıştır.Tez çalışmasının son aşamasında, kitosan doku iskeleleri ile hücre kültürü çalışmaları yapılmıştır. Çalışmalar 4 grup örnekle yürütülmüştür. Birinci gruptaki kitosan doku iskelelerine yalnızca hücre ekilmiş (kontrol grubu), ikinci gruptaki hücreler kültüre edilirlerken, farklılaşma ortamlarına iskele başına 20 ng olacak şekilde rekombinant BMP6 proteini eklenmiştir. Üçüncü gruptaki doku iskelelerine pShuttle-rBMP6 plazmidiyle modifiye edilmiş hücreler ekilmiştir. Dördüncü gruptaki örnekler ise, pShuttle-rBMP6 emdirilmiş kitosan doku iskelelerine mezenkimal kök hücreler ekilerek hazırlanmıştır. Hücre kültür çalışmaları 21 gün boyunca durgun ortamda yürütülmüştür. Plazmid emdirilmiş iskelelerden kültür ortamına salınan DNA miktarı, deneysel çalışmaların devam ettirildiği 21 gün boyunca, spektrofotometrik olarak izlenmiştir. Kitosan doku iskelelerinin, hücrelerin kondrojenik farklılaşmaları için uygun bir sürede ve kontrollü olarak plazmid DNA'nın salımını desteklediği belirlenmiştir. Hücre üremesi MTT (3-(4,5-dimethylthiazoyl-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) analizi ile takip edilmiş, analiz sonucunda modifiye hücrelerin üreme eğilimlerinin daha yüksek olduğu saptanmıştır. Hücre morfolojileri SEM ile görüntülenmiş, kontrol grubundaki hücrelerin hipertrofik bir morfolojiye sahip oldukları, BMP6 ile modifiye olmuş hücrelerin ise kondrojenik fenotipte oldukları gözlemlenmiştir. Plazmid aktarılmış hücrelerde BMP6 geninin ifadesi ELISA testiyle kantitatif olarak saptanmış, böylece hücrelere gen aktarımının gerçekleştiği doğrulanmıştır. Ayrıca bu analizle, dolaylı olarak iki farklı yolla gerçekleşen transfeksiyonun birbirine yakın verimlilikte olduğu saptanmıştır. Kondrogenezin kantitatif olarak değerlendirilmesi ve farklı gruplardaki DNA içeriklerinin karşılaştırılması için biyokimyasal analiz yapılmıştır. İki haftalık ve üç haftalık periyod sonunda yapılan ölçümlerde, modifiye hücreleri içeren doku iskelelerinin, glikozaminoglikan (GAG) ve DNA içeriğinin, diğer gruplarla karşılaştırıldığında daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Gen ile aktifleşmiş kitosan doku iskelelerindeki modifiye hücrelerin, lipozomal ajanla transfekte edilenlere göre daha fazla GAG sentezledikleri belirlenmiştir.Elde edilen sonuçlar değerlendirilerek, BMP6 geni ile modifiye edilmiş sıçan mezenkimal kök hücreleri ve üç boyutlu kitosan doku iskelelerinden oluşan yapının, kondrogenezin sağlanmasında etkin bir sistem olabileceği ve klinik uygulamalarda kıkırdak onarımına yönelik olarak kullanılabileceği sonucuna varılmıştır.