Mukopolisakkaridoz tarama - tanı testlerinin kurulması ve referans aralıklarının belirlenmesi
Tezin Türü: Tıpta Uzmanlık
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Tıp Fakültesi (Türkçe), Temel Tıp Bilimleri Bölümü, Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: KHALED EL MOUSTAFA
Danışman: İncilay Lay
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Mukopolisakkaridozlar (MPS), lizozomlarda glikozaminoglikanların (GAG) yıkımında görev alan enzimlerin kalıtsal bozukluğu sonucu oluşan bir grup lizozomal depo hastalıklarıdır (LSD). Mutasyonlar sonucu enzim bozuklukları ile yıkılamayan GAG'lar hücre, doku, organlarda birikir ve biriken GAG tipine göre farklı klinik tablolarda, kronik, ilerleyici, çoklu sistem tutulumunun görüldüğü MPS'lar ortaya çıkar. Başlıca GAG'lar; kondroitin-4-sülfat, kondroitin-6-sülfat, heparan sülfat, dermatan sülfat, keratan sülfat ve hyaluronik asittir. MPS'ların günümüze kadar 7 tipi ve birçok alt tipleri tanımlanmıştır. MPS II hariç hepsi otozomal resesif kalıtım gösterirler. MPS'ların farklı tiplerinde bozuk olan enzime göre 4 farklı GAG (dermatan sülfat, keratan sülfat, heparan sülfat ve kondroitin 4- ve 6-sülfatlar) birikir ve idrarla çok fazla miktarda GAG atılımı görülür. Nadir görülen hastalıklar olarak bilinirler fakat tüm MPS'lar için toplu insidans 1/25000'dir. Klinik tanı güç olduğu için insidansın daha yüksek olduğu tahmin edilmektedir. Akraba evlilikleri oranının %21 olduğu Türk toplumunda MPS'ların diğer toplumlara göre daha sık görüldüğü düşünülmektedir. Klinik tanının güç olduğu MPS'larda tanı, laboratuvar tarama ve tanı testleri ile konulur. MPS tiplerinin tanısı tedavi için önemlidir. Son yıllarda MPS I, MPS II, MPS IVA ve MPS VI için rekombinant enzim yerine koyma tedavisi (ERT) uygulanmakta ve diğer tipler için çalışmalar devam etmektedir. MPS'lar için idrarda artmış total GAG atılımını ve GAG tipini tespit etmek ilk basamak laboratuvar tarama testleridir. İdrarda atılan GAG tipi belirlenerek olası MPS tipleri tespit edilir ve kesin tanı lökosit veya fibroblast hücrelerinde spesifik enzim aktivite ölçümleri ile konulur. Bu çalışmada Hacettepe Merkez Laboratuvarına MPS laboratuvar tarama ve tanı testlerinin kurulması, analitik ve klinik performanslarının validasyon çalışmaları ile belirlenmesi, Türk toplumuna özgü referans aralıklarının tanımlanması amaçlanmıştır. Validasyon ve referans aralığı çalışmaları CLSI kılavuzu protokollerine göre yapılmıştır. İdrar total GAG analizi dimetilen mavisi metodu (DMB) kullanılarak spektrofotometre ile gerçekleştirilmiştir. Uygun dalga boyu, stabilite (EP25), kesinlik (EP05), doğrusallık, rapor aralığı, geri kazanım (EP06), gerçeklik (EP09), interferans (EP7), limitler (EP17), ROC analizi (GP10) ve referans aralık (C28) çalışmaları yapılmıştır. GAG tipi belirlenmesi selüloz asetat elektroforezi, lökosit spesifik enzim aktivite ölçümleri fluorojenik substratlar kullanılarak fluorometre ve kuru kan enzim aktivite ölçümleri LC-MS/MS ile gerçekleştirilmiştir. İstatistiksel analiz SPSS programı v.21.0 ile yapılmıştır. İdrar total GAG analizinde MPS hastalarını belirlemede en uygun dalga boyu 530 nm olarak bulundu. Farklı GAG konsantrasyonlarında idrar stabilitesinin oda sıcaklığı, +4°C, -20°C ve -80°C'de en az 21 gün süreyle korunabildiği ve idrar örneklerinin laboratuvara oda sıcaklığında ulaştırılabileceği tespit edildi. Kesinlik çalışmalarında, gün içi ve günler arası % ICC değerleri % 99 üzeri ve % CV değerleri % 10'un altında bulundu. Total GAG analizinin tekrarlı ölçümlerde tutarlı, güvenilir, kesin ve rastgele hatanın düşük olduğu belirlendi. Doğrusallığın 240 mg/L kondroitin sülfat A değerinden sonra bozulduğu tespit edildi. Bu değere kadar doğrusal denklem y=0,022+0,010x ve R2= 0,975 olarak belirlendi. Ölçülen ve hedeflenen değer arasında pozitif güçlü bir ilişki gösterildi (R2=0,9972). Eğim, kesme noktası ve standart sapma değerlerinin CLSI'ya göre kabul edilebilir olduğu tespit edildi. Geri kazanım çalışmasında geri kazanım ortalama yüzdesi % 100,83 olarak elde edildi. Örnek hazırlama sırasında GAG'lar korunmaktadır ve yöntem orantısal sistematik bir hataya sahip değildir. Gerçeklik çalışmasında kesinlik çalışmasında elde edilen rastlantısal hata (2,97) ve doğrusallık çalışmasında elde edilen orantısal sistematik hata (8,67) kullanılarak total hata (14,61) hesaplandı. Westgard'a göre metodun total hatası kabul edilir bulundu ve gerçek değeri ölçtüğü tespit edildi. İnterferans çalışmasında, total GAG analizinde proteinüri, hematüri, lökositüri ve pH değişikliği interferansı incelendi. MPS hastalarında gözlenen yüksek total GAG konsantrasyonlarında proteinüri ve hematüri interferansı gözlenmezken, sağlıklı bireylerde gözlenen total GAG konsantrasyonlarında proteinüri ve hematüri interferansı tespit edildi. Farklı GAG konsantrasyonlarda, total GAG analizinin lökositüri ve pH değişikliklerinden etkilenmediği gözlendi. Belli bir kesinlik ve doğruluk değerinde kantitatif olarak ölçülebilen en düşük analit miktarı 23,3 mg/L (LoQ) olarak tespit edildi. Toplam 836 sağlıklı bireyden gerçekleştirilen idrar total GAG analizi ile yaşa bağımlı (0-3 ay, 4-6 ay, 7-12 ay, 1-2 yaş, 2-13 yaş ve >13 yaş) referans aralıkları elde edildi. Toplam 150 sağlıklı bireyden tüm MPS tipleri ve referans enzim için lökosit spesifik enzim aktiviteleri referans aralıkları belirlendi. Toplam 45 MPS hastası tanı aldı. ROC analizinde 2-3 yaş grubu için kesim noktası = 89,858 mg/g kreatinin, ROC eğrisi altındaki alan (AUC) = % 95,7 (p<0,001), duyarlılık %93,33, özgüllük %98,07, PPV ve NPV değerler yüksek bulundu. Toplam 237 sağlıklı birey kuru kan örneklerinde tandem-kütle spektrometresi yöntemi ile multipleks enzim aktiviteleri ölçülerek MPS I, Pompe, Krabbe, Niemann-Pick A/B, Gaucher ve Fabry için referans aralıkları belirlendi. Sonuç olarak çalışmamız ile Hacettepe Merkez Laboratuvarında MPS laboratuvar tarama ve tanı testleri kurulmuştur. Türk toplumuna özgü referans aralıkları belirlenmiştir. MPS'lara özgü tarama ve tanı testleri ile MPS'ların toplumumuzdaki gerçek insidansı belirlenebilecek ve tanı konulan MPS hastalarına erken tedavi seçeneği sağlanabilecektir.