Mezenşimal kök hücrelerin immün modülatör etkisinin hemofagositik sendrom klinik uygulamalarına temel oluşturmak üzere in vitro modelde incelenmesi
Tezin Türü: Doktora
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HANDAN SEVİM
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): ÖZER AYLİN GÜRPINAR
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Hemofagositik sendrom (hemofagositik lenfohistiyositoz, HLH), sitotoksik T lenfositlerin ve makrofajların aşırı aktivasyonu sonucu gelişen ve aşırı uyarılmış bir immün sistemin oluştuğu, tedavi edilmezse ölümcül olan bir immün yetmezlik hastalığıdır. Primer (ailevi) HLH (FHL)'nin bir tipi olan FHL2, perforin gen hasarlı tiptir. Perforin, sitotoksik T lenfositler ve doğal öldürücü (NK) hücrelerinin immün cevabı sırasında, hedef hücre zarında porlar oluşturarak granzimin bu porlardan geçişine ve böylece enfekte hücrenin apoptozla ölümüne aracılık eder. FHL2 hastalarında perforin genindeki mutasyon nedeniyle bu hastaların immün cevabı oluşmamakta ve sürekli uyarılan immün sistem nedeniyle yüksek oranda sitokin salgılanmaktadır. Hastalarda oluşan bu kontrol edilemeyen immün sistem uyarımı nedeniyle, aşırı aktivite gösteren NK hücreleri ve sitotoksik T hücreleri çoklu organ hasarlarına yol açmakta ve sistemik inflamasyona sebep olmaktadır. HLH tedavisinde öncelikli amaç; dekzametazon, siklosprosin A ve etoposidden oluşan uluslararası HLH-2004 protokolü uygulanarak immun sistemin baskılanmasıdır. Ancak FHL'de kesin tedavi hematopoietik kök hücre transplantasyonu (HKHT) ile mümkün olmaktadır. HKHT yapılmayan hastalar için bu hastalık öldürücüdür. Klasik tedavilerde 8. haftanın sonunda tam veya çok iyi yanıt alınamayan hastalarda HKHT kadar geçen sürede çaresiz kalınmaktadır. Mezenşimal kök hücreler, düşük MHC-II ekspresyonları ve sentezledikleri sitokinler ile immün modülatör etkiye sahiptir. GvHD gibi çeşitli otoimmün hastalıklarda MKH'ler immün modülatör etkileri nedeniyle klinikte uygulanmaktadır. FHL2'de MKH'lerin immün modulatör olarak kullanılması ile ilgili literatürde yalnızca 23 yaşındaki bir hastaya yapılan uygulama ile ilgili bilgiler bulunmaktadır. Ancak bu gibi çalışmaların devamı için gerekli temel bilgiyi sağlayacak sistemler bulunmamaktadır. Bu nedenle, tez çalışmamızda perforin gen ifadesi baskılanmış bir insan NK hücre hattı oluşturarak FHL2 için in vitro model geliştirilmesi ve MKH'lerin bu model hücreler üzerindeki immünmodülatör etkisini incelenmesi hedeflenmiştir. Bu amaçla ticari olarak satılan NK hücre hattı olan NK92 hücre hattı seçilmiştir. Bu hücrelerde PRF1 gen ifadesinin baskılanması amacıyla DNA'daki PRF1 gen bölgesini hedefleyen CRISPR/Cas sistemi kullanılmıştır. Hazırlanan sistemle NK92 hücrelerinde perforin gen bölgesine puromisin direnç geni eklenmiştir. Transfeksiyon sonrası hücreler puromisin antibiyotiği ile seçilmiştir. Elde edilen klonlarda perforin geninin hedeflendiği qPCR, PCR ve ELISA yöntemleri ile analiz edilmiştir. Perforin geninin hedeflendiği PMA/İyonomisin ile uyarılmış klonlarda perforin ifadesinin baskılandığı qPCR analizi ile perforin salgılamadığı ELISA yöntemi ile gösterilmiştir. Elde edilen klonlar MKH'lerle ko-kültür edilmiş ve ko-kültür sisteminden elde edilen süpernatanlara çoklu sitokin analizi yapılmıştır. Sitokin analizinde ortamdaki immünmodülatör sitokinlerin (IL-4 ve IL-10) miktarının arttığı, ancak sistemi uyarıcı sitokinlerin ise (IL-6, IL-8, GM-CSF, G-CSF, IFNγ, TNFα) miktarının azaldığı görülmüştür. Bu sonuçlar MKH'lerin immün modülatör etkisini in vitro FHL2 modelli hücre hattında gösterdiğini desteklemektedir. Bu tez kapsamında, MKH'lerin immunmodülatör etkisi, insan kökenli MKH ve NK hücre hattı kullanılarak in vitro sistemde gösterilmiştir. Bu in vitro sistemden elde edilen sonuçların, in vivo ve klinik uygulamalar için çok önemli bir basamak olduğu düşünülmektedir. Aynı zamanda günümüzde devam eden klinik çalışmalarda GvHD gibi immun sistem hastalıklarının tedavisinde MKH'lerin kullanıldığı görülmektedir. Bu nedenle MKH'lerin klinikte klasik tedavilerde çaresiz kalınan FHL2 hastalarında kemik iliği transplantasyonuna kadar geçen sürede destekleyici ve yan etkisi çok düşük bir tedavi olarak kullanılması önerilmektedir.