Kemik hasarları için vaskülarize kemik doku mühendisliği: 3B biyoyazıcı ile hidrojel/hücre/biyosinyal sistemlerin hazırlanması

TUĞRUL TOLGA DEMİRTAŞ

Kemik hasarları için vaskülarize kemik doku mühendisliği: 3B biyoyazıcı ile hidrojel/hücre/biyosinyal sistemlerin hazırlanması

Tezin Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye

Tezin Onay Tarihi: 2016

Tezin Dili: Türkçe

Öğrenci: TUĞRUL TOLGA DEMİRTAŞ

Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): MENEMŞE GÜMÜŞDERELİOĞLU

Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu

Özet:

Tezin sahibi Tuğrul Tolga Demirtaş, doktora tez dönemi boyunca Tübitak 2211-C Öncelikli Alanlar Tez Teşvik Bursu kapsamında ve Amerika Birleşik Devletleri Stanford Üniversitesinde gerçekleştirdiği çalışmaları için ise 2214-A Yurt Dışı Doktora Sırası Araştırma Bursu kapsamında (9 ay) desteklenmiştir. Sunulan tez çalışması kapsamında üç boyutlu ''Bottom-up'' (aşağıdan yukarıya) biyofabrikasyon yöntemleri (biyoyazıcı ve 3B fotolitografi sistemi) kullanılarak hücre yüklü hidrojellerin 3B baskılanması ve hidrojellerin in-vitro kemik doku mühendisliği ve vaskülarize kemik doku modeli oluşturulması alanında kullanım potansiyellerinin belirlenmesi hedeflenmiştir. Tezin ilk aşamasında, 3B biyoyazıcı kullanılarak baskılanan MC3T3-E1 (pre- osteoblast) yüklü kitosan ve kitosan-HA hidrojellerinin karakterizasyonu aljinat ve aljinat-HA hidrojeller ile karşılaştırılarak belirlenmiştir. Kitosan çözeltisinin ve nano yapıdaki kemik benzeri hidroksiapatit (n-HA) ile kompozit çözeltisinin literatürde ilk defa hücrelerle karıştırılarak başarılı bir şekilde baskılanabilirliği gösterilmiştir. Reolojik analiz ile tüm grupların viskoelastik karaktere sahip oldukları belirlenmiş ve fizyolojik koşullar taklit edildiğinde (37°C vücut ortamı), kitosan ve kitosan-HA hidrojellerinin kararlı ve elastik yapıda olduklarını gösterilmiştir. Biyoçözeltilerin viskozite değerlerinin 3B biyoyazıcıda kullanılabilir aralıkta olduğu görülmüştür. Hücre canlılığı ve proliferasyonu analizleri ile hücrelerin biyoçözeltiler ile baskılandıktan sonra canlılıklarını bütün gruplarda devam ettirdiği, ancak kitosan ve kitosan-HA hidrojelleri içinde enkapsüle edilen MC3T3-E1 hücrelerinin aljinat hidrojeline göre hücre canlılığı ve proliferasyonunu daha fazla desteklediği gösterilmiştir. Hücre farklılaşmasının moleküler düzeyde incelenmesi amacıyla gerçek zamanlı polimeraz zincir reaksiyonu (RT-PCR) yapılmıştır. Gruplar arasında karşılaştırma yapıldığında, kitosan-HA kompozit hidrojeli içinde 3B baskılanan hücrelerin Kol-1, RunX2, Ocn ve Opn ekspresyonları en yüksek düzeyde bulunmuştur. Kolorimetrik olarak hidrojeller içinde yer alan hücrelerin ürettiği kalsiyum miktarı, RT-PCR analizinde yapılan Ocn ve Opn analizi sonuçları ile uyumlu olarak artış göstermiştir. Kitosan ve kitosan-HA hidrojelleri içinde yer alan hücrelerin 21 günlük kültür sürecinde mineralize olduğu ve osteojenik olarak farklılaştığı sonucuna varılmıştır. Biyoyazıcı sistemlerde en çok kullanılan aljinat çözeltisi ile karşılaştırıldığında kitosanın hücre üremesinde ve farklılaşmasında aljinata olan üstünlükleri de gösterilmiştir. Böylece bir biyoyazıcı çözeltisi olarak kitosanın baskılanabilirliği ve uygunluğu açık bir şekilde kanıtlanmıştır. Ayrıca kemik benzeri n-HA' nın varlığının aljinat ve kitosan hidrojeller içindeki hücrelerin canlılığını, proliferasyonunu ve osteojenik farklılaşmasını daha fazla arttırdığı gösterilmiştir. Tezin ikinci aşamasında ise, fotolitografi ile 3B mikrojeller içerisinde enkapsüle edilen yeşil floresan protein ile işaretlenmiş insan göbek veni endotel hücreleri (GFP-HUVEC) ve insan kemik iliği kök hücreleri (hBMSC) hücreleri, farklı desenlerde baskılanarak yapılan in-vitro ko-kültür çalışmaları ile vaskülerize kemik modeli geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla, ilk olarak metakrilik anhidrid ile fonksiyonlandırılan jelatin (Jel-MA) fotobaşlatıcı varlığında UV ile fotoçapraz bağlanarak vücut sıcaklığında kararlı hidrojel formuna getirilmiştir. GFP-HUVEC hücreleri, %5 (w/v) ve %7.5'luk iki farklı jel-MA konsantrasyonunda desenlerin hem halka kısmına hem de halka kısmının dışına başarılı bir şekilde baskılanmışlardır. Yapılan floresan görüntülemeler sonucu, hidrojel matrisin yapısal bütünlüğünü 21 günlük kültür süresince koruduğu gözlenmiştir. Deneysel çalışmalar sonucunda GFP-HUVEC hücrelerinin oluşturulan desenin dış kısmında %5 Jel-MA içerisinde, hBMSC hücrelerinin ise %7.5 Jel-MA+%2.5 metakrilatlanmış aljinat (OMA) içerisinde desenin halka kısmına baskılanmasına karar verilerek vaskülerize kemik modeli oluşturulmuştur. Halka yapısının dışına enkapsüle edilen GFP-HUVEC hücreleri organize olarak prevasküler bir yapı oluştururken halka deseninde enkapsüle edilen GFP- HUVEC hücrelerinin herhangi bir prevasküler ağ yapısı oluşturmadığı görülmüştür. Bu durumdan, hücrelerin tübüler yapıda organize olabilmeleri için 500 μm çapına sahip halka desenin yetersiz olduğu ve daha geniş bir yüzey alanı içerisinde enkapsüle edildiklerinde (halka dışına) prevasküler ağı oluşturdukları sonucuna varılmıştır. İmmünositokimyasal analizlere göre oluşturulan kapiler ağın CD31 pozitif olduğu gösterilmiştir. Vasküler kısım için yapılan immünositokimya analizlerinde hücrelerin laminin ve kollajen tip IV gibi endotel hücrelere ait ECM proteinlerini salgıladıkları gösterilmiş ve SEM görüntüleri ile uyumlu olarak olgun damar ağının oluşturulduğu belirlenmiştir. Kemik kısmı için yapılan immünositokimya analiz sonuçları; OCN, OPN ve RUNX2 antijenlerinin pozitif olduğunu ve hBMSC hücrelerinin iç ve dış kısımda konumlandırılmalarının osteojenik farklılaşmaya bir etkisi olmadığını, hücrelerin her iki koşulda da farklılaşmaya gittiklerini göstermektedir. Tez kapsamında kemik benzeri n-HA'in, osteojenik farklılaşmaya ve mineralizasyona etkisi osteojenik farklılaşmada oldukça sık kullanılan bir büyüme faktörü olan rhBMP-2 ile karşılaştırılmıştır. İmmünositokimya boyamaları sonucunda kemik benzeri hidroksiapatit içeren, BMP-2 içermeyen (+HA/-BMP 2) grubun kemik farklılaşma belirteçlerinin (OCN ve OPN) yalnızca BMP-2 içeren grup kadar olduğu görülmüştür. Dolayısıyla üretimi BMP-2'ye göre oldukça kolay ve ucuz olan kemik benzeri n-HA'in BMP-2 yerine osteojenik farklılaşmayı indükleyici ajan olarak kullanılabilir olduğu kanıtlanmıştır. Yapılan in-vitro hücre kültür çalışmaları ile Jel-MA hidrojeli içerisinde 3B olgun pre-vasküler yapı başarı ile oluşturulmuştur ve aynı şekilde hBMSC hücreleri tamamen olgun osteoblast hücrelerine farklılaştırılarak vasküler bir kemik modeli başarıyla elde edilmiştir. Farklı hücrelerin 3B olarak farklı desenlere baskılanmasına imkan veren bu yöntem, ilaç çalışmaları için vaskülarize mikro organların veya insan hastalık modellerinin oluşturulması için çok uygun bir sistem olarak ifade edilebilmektedir.