CCP antikorlarının tayini için yüzey plazmon rezonans temelli biyosensörlerin hazırlanması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: HÜSEYİN DİBEKKAYA
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): ADİL DENİZLİ
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Romatoid artrit (RA) sık rastlanan kronik eklem iltihabı ile tanımlanan bir otoimmün hastalığıdır. Dünya nüfusunun yaklaşık %1'i RA hastalığından muzdariptir. Kadınları erkeklerden daha fazla (3-5 kat) etkilemektedir. RA'nın hem eklemsel hem de sistemik etkileri vardır. Şimdiye kadar RA teşhisinde en yaygın olarak romatoid faktör (RF) tayini kullanılmaktadır. Romatoid faktörler gamma globulinler ile reaksiyona giren ve genellikle IgM sınıfı antikorlardır. RA hastalarının %60 ile %80'inde bulunurlar. RF, RA için hassas ama spesifik olmayan bir işaretleyicidir. Çünkü sağlıklı bireylerde veya diğer otoimmün hastalığı olan bireylerde de bulunur. RA hastalarının %40-60'ında epidermal flagrine karşı antikorlar gözlenir. Sitrülin, filagrin molekülünde bulunan nadir bir aminoasittir. Son araştırmalarda sitrülinin, filagrindeki antijenik epitopun yapısal bir parçası olduğu gösterilmiştir. Siklik peptid içeren sitrulin antikorları (anti-cyclic citrullinated peptide, anti-CCP) RA için yeni ve RF'den çok daha spesifik (anti-CCP: %96-%100, RF: %63) bir parametre olarak bildirilmektedir. Ayrıca CCP ile RF'in duyarlılıkları arasında belirgin bir fark yoktur (anti-CCP: %80, RF: %79). CCP'ye karşı oluşan antikorlar, çoğunlukla IgG sınıfındandır. Hastaların %70 ile %80'inde hastalığın erken aşamasında, çoğunlukla hastalığın semptomları ortaya çıkmasından çok önce tespit edilebilir. Moleküler baskılanmış polimerler (MIP) hazırlanması kolay, ucuz, kararlı, moleküler tanıma yeteneği olan ve ayrıca büyük miktarlarda üretilebilen ve tekrar kullanılabilen malzemelerdir. Bu yüzden, MIP'ler yapay molekül tanıyan malzemeler olarak tanımlanabilir. Adsorpsiyon temelli moleküler tanıma teknikleri hedef molekülleri için gösterdikleri yüksek seçicilikten dolayı bazı alanlarda dikkatleri üzerine çekmiştir. Yüzey plazmon rezonans (SPR), metal yüzeye yakın kırılma indisindeki değişiklikleri ölçmede kullanılan kusursuz bir yöntemdir. SPR temelli biyosensörler, herhangi bir işaretlemeye gerek olmaksızın biyomoleküller arasındaki etkileşimleri ölçmede kullanılabilir. Etkileşimleri eş zamanlı, doğrudan ölçebilmek kinetik veya termodinamik parametrelerin, derişimin veya ligand-analit arasındaki etkileşimlerin belirlenebilmesini sağlamaktadır. SPR temelli biyosensörler, hızlı cevap süresine ve yüksek seçiciliğe sahip olduğu için enzim veya radyoişaretleme yöntemleri gibi diğer tekniklerle karşılaştırıldığında, protein-protein, antikor-antijen, reseptör-ligand etkileşimlerinden, düşük molekül ağırlıklı bileşiklerin tanımlanmasına kadar çok çeşitli biyomoleküler mekanizmaların anlaşılmasında kullanılabilir. Sunulan çalışmanın amacı, anti-CCP antikor tayini için anti-CCP baskılanmış yüzey plazmon rezonans temelli biyosensör hazırlamaktır. Bu amaçla, SPR biyosensör allil merkaptan ile modifiye edilmiş ve allil gruplarının yönlenmesi sağlanmıştır. İlk basamakta, akrilamid (AAm) monomeri, kalıp monomer olarak kullanılan anti-CCP ile etkileştirilerek anti-CCP/AAm ön-kompleksi sentezlenmiştir. Optimum kalıp molekül ve monomer oranını belirlemek için anti-CCP ve farklı oranlarda AAm karıştırılmış ve optimum oran UV-görünür bölge spektrofotometre kullanılarak tespit edilmiştir. Daha sonra anti-CCP molekülleri çapraz bağlayıcı metilen bisakrilamid (MBAAm) varlığında anti-CCP/AA ön-kompleks ile reaksiyona sokularak moleküler baskılanmış (anti-CCP/PAAm) SPR biyosensörü elde edilmiştir. Baskılamada amonyum persülfat (APS) ve N,N,N',N'-tetrametilendiamin (TEMED) işleminde başlatıcı çifti olarak kullanılmıştır. Ayrıca kontrol deneyi için kalıp molekül olan anti-CCP molekülü kullanılmadan, baskılanmamış (PAAm) SPR biyosensörü de hazırlanmıştır. Hazırlanan anti-CCP/PAAm ve PAAm SPR biyosensörler, FTIR-ATR, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), elipsometre ve temas açısı ölçümleriyle karakterize edilmiştir. Kalınlık ölçümleri ve AFM görüntüleri, anti-CCP moleküllerinin biyosensör yüzeyine hemen hemen tek tabakalı olarak baskılandığını göstermektedir. Adsorpsiyon çalışmaları için 10 mM pH 7.0 fosfat tamponu kullanılırken, desorpsiyon çalışmaları için de %1 Tween 20, %10 asetik asit (HAc) içeren çözelti kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Anti-CCP/PAAm ve PAAm SPR biyosensörlerin anti-CCP tayin seçiciliği, anti-CCP, immunoglobulin M (IgM)ve sığır serum albümin (BSA) çözeltileri (pH 7.0 fosfat tamponunda) ve seyreltilmiş plazma örnekleri ile araştırılmıştır. Anti-CCP/PAAm SPR biyosensörü, PAAm SPR biyosensörüne göre IgM ve BSA'ya daha fazla seçicilik göstermiştir. Anti-CCP/PAAm SPR biyosensör ile anti-CCP çözeltisi arasındaki etkileşim modelini belirlemek amacıyla Scatchard, Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) olmak üzere dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır. Langmuir adsorpsiyon modeli, bu afinite sistemi için en uygun model olarak bulunmuş ve sonuçlar anti-CCP/PAAm SPR biyosensör yüzeyindeki anti-CCP bağlanma bölgelerinin homojen dağılımlı ve tek tabakalı olduğunu göstermiştir. Sonuçlar, anti-CCP/PAAm SPR biyosensörün anti-CCP için yüksek seçiciliğe ve duyarlılığa sahip olduğunu göstermektedir.