Mikroalbumin tayini için SPR temelli nanosensörlerin hazırlanması
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Kimya A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2017
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: MELTEM KOCA ESENTÜRK
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): ADİL DENİZLİ
Özet:İnsan Serum albümini (HSA) kanda en çok bulunan proteindir. Böbreklerde oluşan hasarlar, glomerüllerdeki gözeneklerin genişlemesine ve fazla miktarda plazma proteinin idrara sızmasına neden olmaktadır. İdrara sızan HSA'nın belli bir miktarı (spot idrarda 0-20 mg/L) mikroalbümin olarak tanımlanmaktadır. Mikroalbümin miktarının artması önemli bazı hastalıkların habercisi olduğundan erken tayini oldukça önemlidir. Biyolojik cevabı elektriksel sinyallere dönüştüren cihazlara "Biyosensör" denir. Biyosensörler bünyesinde biyolojik tanıma elemanı bulunduran ve fizikokimyasal dönüştürücü içeren analitik cihazlardır. Biyosensör alanındaki büyük gelişmelerle birlikte moleküler baskılanmış polimerler (MIP) dönüştürücülerle birleştirilmiş ve tayin edilecek analitle MIP arasındaki etkileşim işlenilebilir bir sinyale dönüştürülmüştür. Bu anlamda yüzey plazmon rezonans (SPR) temelli optik cihazlar büyük bir potansiyele sahiptirler. Bu çalışmada, idrarda mikroalbümin tayinine yönelik moleküler baskılama tekniği kullanarak, SPR temelli nanosensör hazırlanması amaçlanmıştır. İlk aşamada HSA ile etkileşerek boşluklar oluşturabilecek fonksiyonel N-Metakriloil-(L)-Lösin Metil Ester (MALM) monomeri, L-Lösin metil esterin metakroil klorür ile reaksiyonu sonucu elde edilmiştir. Optimum kalıp molekül HSA ve MALM monomeri oranı, HSA'nin farklı oranlarda MALM monomeri ile etkileştirilmesiyle UV-görünür bölge spektrofotometre cihazıyla tespit edildi ve optimize edilen bu orana göre nanosensör hazırlama çalışmaları gerçekleştirildi. Nanosensör hazırlama çalışmaları sırasıyla Mikro-temas yöntemi ile HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanosensörlerin hazırlanması ve HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin sentezlenmesiyle iki farklı şeklinde gerçekleştirildi. Belirlenen amaç doğrultusunda mikro-temas yöntemiyle alil merkaptan ile modifiye edilmiş SPR sensör yüzeyinde, HSA baskılanmış poli(N-Metakriloil-(L)-Lösin Metil Ester-insan serum albümin) [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm sentezlenmiştir. Belirli oranlarda hazırlanan MALM monomeri, çapraz bağlayıcı etilen dimetakrilat (EDMA) ve başlatıcı 2,2'-azobis(izobütironitril) (AIBN)'den oluşan karışımından 20 µl alınarak damlatılan SPR sensör çip yüzeyine, lam üzerinde hazırlanan kalıp protein HSA baskılanmıştır. Bu preparatın UV ışık altında 4 saat bekletilmesiyle hedef protein HSA'ya ait özel boşluklar oluşturulmuştur. Kontrol deneyleri için hedef protein HSA eklemeden aynı koşullarda baskılanmamış nanofilm hazırlanmıştır. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmler ile hazırlanan SPR nanosensörlerin karakterizasyon çalışmaları FTIR-ATR, Atomik kuvvet mikroskobu (AFM), Temas açısı (CA) ve Elipsometre ölçümleri ile gerçekleştirilmiştir. AFM ölçümlerinden elde edilen pürüzlülük değerleri HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanoflimler için sırasıyla 3,64 ve 2,47 nm olarak bulunmuştur. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmlerin pürüzlülük değerleri arasındaki farklılık HSA moleküllerinin başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilmlerin film kalınlığı elipsometri ile ölçülmüş ve sırasıyla 89,9±6,3 ve 95,0±4,9 olarak bulunmuştur. Islanabilirlik çalışmaları temas açısı ölçümü ile gerçekleştirilmiştir. Modifiye edilmemiş altın yüzey için (80°±0,73), HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm yüzey için (55,2°±2,24) ve HSA baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilm yüzey için (61,5°±4,63) elde edilen artan temas açısı değerleri baskılama işleminin hidrofilikliği arttırdığını göstermektedir. Hedeflenen derişim aralığına inmek amacıyla çalışmanın ikinci kısmında HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanopartiküller iki fazlı miniemülsiyon polimerizasyon yöntemiyle sentezlenmiştir. Faz I; PVA (95 mg), SDS (15 mg) ve NaHCO3'ın (12 mg) 5,0 mL deiyonize su içinde çözülmesiyle hazırlanmıştır. Faz II; PVA (50 mg) ve SDS'in (50 mg) 100 mL deiyonize suda çözülmesiyle hazırlanmıştır. Hazırlanan MALM:HSA ön-kompleksi (0.15:0,015 mmol), çapraz bağlayıcı monomer EDMA ile (4,8 mmol) karıştırılarak yağ fazı elde edilmiştir. Yağ fazı faz I'e yavaşça eklenmiştir. Karışım, 25.000 rpm de homojenizatörde homojenize edildikten sonra Faz II ile karıştırılmıştır. Sodyum bisülfit (50 mg) ve amonyum persülfat (100 mg) başlatıcısının eklenmesinden sonra polimerizasyon işlemi 40°C de 24 saat süreyle gerçekleştirilmiştir. Kontrol deneyleri için HSA baskılanmadan hazırlanan nanopartiküller aynı koşullarda sentezlenmiştir. Sentezlenen nanopartiküller, zeta boyut analizi ve taramalı elektron mikroskobu (SEM) ile karakterize edilmiştir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin ortalama boyut dağılımı zeta boyut analizörü ile ölçülerek sırasıyla 63 ve 55 nm şeklinde bulunmuştur. Baskılanmış ve baskılanmamış nanopartiküller için düşük polidispersite indeks değerleri (PDI:0,138; PDI:0,113) nanopartiküllerin ortalama boyut dağılımının homojen olduğunu göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanopartiküllerin büyüklüğü ise taramalı elektron mikroskobu ile ölçülmüş ve ortalama boyutları 60-65 nm aralığında bulunmuştur. Etil alkol ile temizlenerek vakumlu etüvde kurutulan altın çip yüzeyine sentezlenen HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin 100 kat seyreltilmiş çözeltisinden 5 µl damlatılarak UV ışık altında 2 saat bekletilmesiyle nanopartiküllerin çip yüzeyine tutturulması sağlanmıştır. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin tutturulmasıyla hazırlanan SPR nanosensörler FTIR-ATR, atomik kuvvet mikroskobu (AFM), temas açısı (CA) elipsometre ölçümleri ile karakterize edilmiştir. AFM ölçümlerinden elde edilen pürüzlülük değerleri HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküller için sırasıyla 1,61 ve 1,28 nm olarak bulunmuştur. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin pürüzlülük değerleri arasındaki farklılık HSA moleküllerinin başarılı bir şekilde baskılandığını göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanopartiküllerin film kalınlığı elipsometri ile ölçülmüş ve sırasıyla 118,4±0,3 ve 116,7±0,3 nm olarak bulunmuştur. Islanabilirlik çalışmaları temas açısı ölçümü ile gerçekleştirilmiştir. Modifiye edilmemiş altın yüzey için (80°±0,73), HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm yüzey için (67,3°±2,24) ve HSA baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) nanofilm yüzey için (84,5°±4,63) elde edilen artan temas açısı değerleri baskılama işleminin hidrofilikliği arttırdığını göstermektedir. HSA tayini için mikro-temas yönteminde 1,5-300 nM derişim aralığında çalışılırken, nanopartiküller ile HSA tayininde 0,15-500 nM gibi daha geniş derişim aralığında 50 mM pH 7,4 fosfat tamponunda hazırlanan HSA çözeltileri ile çalışılmıştır. Desorpsiyon ajanı olarak 0,05 M NaCl çözeltisi kullanılmıştır. Farklı derişimlerde yapay plazma ve yapay idrar örneklerin de HSA analizleri fosfat tamponu ortamında (pH 7,4) gerçekleştirilmiştir. Hazırlanan HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) ve baskılanmamış [PEDMALM] (NIP) sensörlerin seçiciliğini göstermek için yarışmacı ajan olarak seçilen farklı proteinler ile (hemoglobin-transferrin) çalışmalar yapılmıştır. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensörün tespit edilen seçicilik faktörünün, nanopartikül tutturularak hazırlanan [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensörün seçicilik faktöründen büyük olduğu tespit edilmiş ve Hb ve HTR için değerleri sırasıyla k'= 5,02, k'= 4,25 olarak hesaplanmıştır. Mikro-temas ve nanopartiküllerle hazırlanan nanosensörlerin tayin limitleri (LOD) sırasıyla 8,8 ve 0,7 pM olarak hesaplanmıştır. Mikro-temas ve nanopartiküllerle hazırlanan nanosensörlerin tekrar kullanılabilirlik çalışmaları sırasıyla 300 ve 500 nM çözeltiler için arka arkaya 5 kez yapılarak reflektans değerleri ölçülmüştür. Kararlılık çalışması için aynı nanosensör çip 3 aylık periyotlarla 3 kez 4 tekrarlı HSA analizi için kullanılmış ve SPR nanosensörlerin kararlılığı gösterilmiştir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanofilm tutturulmuş SPR nanosensör ile HSA arasındaki etkileşimlerin kinetik ve adsorpsiyon modelini belirlemek amacıyla dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır: Scatchard Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) modelleri. Langmuir adsorpsiyon izoterm modelinin bu afinite sistemine en uygun model olduğu görülmüş ve sonuçlar HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensördeki HSA'e afinite gösteren bağlanma bölgelerinin homojen olarak dağıldığını ve tek tabakalı yapı oluşturduğunu göstermektedir. HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanopartikül tutturulmuş SPR nanosensör ile HSA arasındaki etkileşimlerin kinetik ve adsorpsiyon modelini belirlemek amacıyla dört farklı izoterm modeli uygulanmıştır: Scatchard, Langmuir; Freundlich ve Langmuir-Freundlich (LF) modelleri. SPR sensörün düşük derişimlerde Langmuir adsorpsiyon izoterm modeline, yüksek derişimler de ise Freundlich adsorpsiyon izoterm modeline uygun olduğu görülmüştür. Sonuçlar HSA baskılanmış [PEDMALM-HSA] (MIP) nanosensördeki HSA'e afinite gösteren bağlanma bölgelerinin homojen olarak dağıldığını ve düşük derişimler için tek tabakalı yapı oluşturduğunu göstermektedir. Sonuç olarak 0-20 mg/L (0-303 nM) aralığındaki HSA derişimi mikroalbümin işaretçisi olarak kabul edilmektedir. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensörün HSA tayininde nanopartiküllerle hazırlanan nanosensöre göre daha seçici olduğu tespit edildi. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensör 1,5-300 nM konsantrasyon aralığındaki HSA tayininde başarılı bir şekilde kullanılabilmesine rağmen 0-300 nM konsantrasyon aralığındaki HSA yı tam olarak tayin edemediği için daha düşük tayin limitlerine inilmesine gerek duyulmuştur. Böylece nanopartiküler kullanılarak hazırlanan nanosensör ile daha düşük tayin limitine inilmiştir. Mikro-temas yöntemiyle hazırlanan nanosensör HSA tayinini, seçici, duyarlı, herhangi bir işaretlemeye ihtiyaç duymadan, diğer yöntemlere göre, düşük maliyet, hızlı ve gerçek zamanlı yapabilmektedir ve nanopartiküllerde düşük HSA derişimlerinin tayininde kullanılabilmektedir. Bu çalışmanın HSA tayinine yönelik, mikro-temas yöntemiyle nanofilm tututurularak hazırlanan nanosensörün ve nanopartikül tutturularak hazırlanan nanosensörün avantajlarının karşılaştırılması bakımından, literatüre katkı sağlayacağı düşünülmektedir.