Research Information System
Tüm Paydaşlarıyla Aşı ve İmmünizasyon Kongresi 2025, Ankara, Turkey, 29 November - 02 December 2025, pp.47-52, (Full Text)
Dirençli Escherichia coli kaynaklı dış zar veziküllerinin (OMV) izolasyonunda kullanılan başlıca yöntemleri —ultrasantrifüj (UC), teğetsel akış filtrasyonu (TFF), afinite/iyon değişim kromatografisi (IEC, ExoBacteriaTM OMV Isolation Kit) —verim, saflık, partikül özellikleri ve işlevsellik açısından karşılaştırmak; ölçeklenebilir ve aşı çalışmalarına uygun bir standart iş akışı geliştirmek amacıyla dirençli E. coli (MALDI-TOF ile tanımlanmış ve antibiyogram testi ile dirençli olduğu gösterilmiş) LB Lennox broth, 37°C sıcaklık, 180 rpm çalkalama kültür koşullarında toplam hacim 500 ml olacak şekilde çoğaltılmıştır. Ardından 5.000×g, 20 dk, 4 °C santrifüj ile hücrelerin uzaklaştırılması ve süpernatant yeni tüpe alındıktan sonra tekrar 5.000×g, 20 dk, 4 °C santrifüj; sonrasında süpernatantın önce 0,45 µm ve ardından 0,22 µm filtreden geçirilmesinin ardından kalan materyalin temiz bir tüpe alınması basamaklarıyla ön saflaştırma yapılmıştır. Paralel kollarda gerçekleştilen izolasyon koşulları; Ultrasantrifüj: 150.000×g, 2 saat, 4 °C sonrası PBS ile yıkama ve ardından pelletin yeniden süspanse edilmesi, Teğetsel akış filtrasyon: 800 kDa MWCO; 20 ml diafiltrasyon hacmi; Affinite/iyon değişim kolonu: 1 saatten az sürede kolon hazırlığı, OMV yakalama ve elüsyon ile OMV toplama işlemi sonrası 1,5 ml OMV eldesi şeklindedir. Zetasizer Advance Pro blue ile boyut dağılımı ve polidispersite indeksi (PDI) ölçümleri ve micro BCA kiti kullanılarak toplam protein miktar analizi ile karakterizasyon çalışması yapılmıştır.
Yöntem | BCA (µg/mL) | Çap (nm±SS) | PDI±ss |
UC | -4,22 | 1365±637,7 | 0,9188±0,1407 |
TFF | 33,54 | 446,4±272,2 | 0,4042±0,1491 |
ExoBacteria™ | 1415,3 | 155,4±18,91 | 0,295±0,06379 |
ExoBacteria™ kiti kullanıldığında elde edilen OMV’ler; hem ortalama boyut dağılımının <200 nm olması hem de en düşük PDI değerine sahip olması nedeniyle homojenlik/kararlılık açısından öne çıkmakta, ayrıca BCA veriminin en yüksek olması sayesinde uygulama hedefine göre verim–homojenlik–kararlılık üçlüsünü en iyi dengeleyen yöntem olarak diğer yaklaşımlara kıyasla tercih edilebilir bir seçenek sunmaktadır.