Rare disease modeling by genome editing tools in zebrafish


Kural Mangıt E., Kayman Kürekçi G., Koyunlar C., Yaylacıoğlu Tuncay F., Önal G., Ünsal Ş., ...More

15. Tıbbi Biyoloji ve Genetik Kongresi, Muğla, Turkey, 27 October 2017, pp.149

  • Publication Type: Conference Paper / Summary Text
  • City: Muğla
  • Country: Turkey
  • Page Numbers: pp.149

Abstract

Rare disease modeling by genome editing tools in zebrafish

 

Objective: H.U Zebrafish Research Laboratory was established in 2015 to study effects of mutations causing rare disorders on the disease phenotype. Using zebrafish as model organism creates great opportunity for rare diseases to understand the molecular mechanism and for discovery of orphan drugs.

 

In our laboratory we use TALEN and CRISPR/Cas9 tools to create mutations in zebrafish genome and investigate the affects of mutations on phenotype.

 

Materials and Methods

For prioritization of candidate genes we knock-out the candidate rare disorder genes which are identified by researchers from our university using exome sequencing. We also optimize protocols to identify the frequent mutations cause rare disorders. Examples are; co-injection of two gRNAs for large deletion of the region of interest, co-injection of gRNA and ssODN for point mutations, using plasmid as donor for large insertions. Furthermore, after the generation of LGMD2R mutation we perform analysis in RNA and protein level to clarify the phenotype.

Results:

Genes related to rare disorders was knocked-out using CRISPR/Cas9 in gene prioritizaiton studies. Legibility of these mutant genes as disease-causing are in research. Generation of frequent mutations in rare disorders are ongoing. Besides to explain pathogenesis of LGMD2R, the mutation was created and most of the study on understanding disease phenotype were completed. Our goal is to maintain mutant zebrafish lines and sperm-freezing to create a library.

Conclusion:

 

Along with modeling of rare disorders in zebrafish using genome editing tools, patient-specific modeling and revealing the pathogenesis and high-throughput screening of candidate orphan drugs will be possible.

 

 

Nadir hastaliklarin genom düzenleme araçlari kullanilarak zebra baliğinda modellenmesi

 

Genel Bilgi

H.Ü Zebra Balığı Araştırma Laboratuvarı, nadir hastalıklara neden olan mutasyonların fenotip üzerindeki etkilerinin araştırılması amacıyla 2015 yılında kurulmuştur. Nadir hastalıkların moleküler mekanizmalarının anlaşılması ve yetim ilaçlarının keşfi için zebra balığının model organizma olarak kullanımı nadir hastalıklar için önemli bir fırsat sağlamaktadır.

Laboratuvarımızda zebra balığı genomunda mutasyon oluşturmak üzere TALEN ve CRISPR/Cas9 genom düzenleme araçları kullanılmakta ve mutasyonların fenotipe etkileri araştırılmaktadır.

Gereç ve Yöntem

Aday gen önceliklendirme çalışmaları kapsamında Üniversitemiz araştırıcıları tarafından ekzom dizileme çalışmaları sonucunda belirlenen nadir hastalık aday genleri KO edilmektedir. Ayrıca, nadir hastalıklarda sık görülen mutasyon tiplerinin zebra balığı genomunda oluşturulabilmesi amacıyla; geniş delesyon için ilgili bölgeyi kapsayan iki gRNA’nın aynı anda enjeksiyonu, nokta mutasyonu için gRNA ile birlikte tek zincirli oligonükleotit enjeksiyonu, geniş insersiyon için donör olarak plasmid enjeksiyonu gibi farklı protokollerin optimizasyonu yapılmaktadır. İlaveten, LGMD2R’de mutasyon oluşturulduktan sonra fenotipin açıklanmasına yönelik RNA ve protein düzeyinde analizler yapılmaktadır.

Bulgular

Gen önceliklendirme çalışmalarında nadir hastalıklar ile ilişkilendirilen genler CRISPR/Cas9 ile KO edilmiştir. Bu genlerin hastalıktan sorumlu mutant gen olma nitelikleri araştırılmaktadır. Nadir hastalıklarda sık gözlenen farklı mutasyonların zebra balığı genomunda oluşturulmasına yönelik çalışmalarımız devam etmektedir. Ayrıca, LGMD2R’nin patogenezini  açıklamak için zebra balığında mutasyon oluşturulmuş ve hastalık fenotipini anlamaya yönelik çalışmalar büyük ölçüde tamamlanmıştır.  Mutant zebra balığı soylarının devamlılığını sağlamak ve mutant zebra balığı kütüphanesi oluşturulmak üzere spermlerin dondurulması önümüzdeki süreçteki diğer hedeflerimizdir.

 

Sonuç

Nadir hastalıklarda sık görülen mutasyonların genom düzenleme araçları kullanılarak zebra balığında oluşturulması ile nadir hastalıkların bireye özgül modellenmesi ve bunu takiben patogenezin ortaya konması ve yetim ilaç adaylarının yüksek ölçekli taramaları mümkün olacaktır.