MODELING LGMD2R IN ZEBRAFISH USING GENOME EDITING TOOLS

Kural Mangıt E., Kayman Kürekçi G., Koyunlar C., Yaylacıoğlu Tuncay F., Ünsal Ş., Dinçer P. R.

16. Tıbbi Biyoloji ve Genetik Kongresi, Muğla, Turkey, 27 - 29 October 2017, pp.90

  • Publication Type: Conference Paper / Summary Text
  • City: Muğla
  • Country: Turkey
  • Page Numbers: pp.90
  • Hacettepe University Affiliated: Yes

Abstract

Modeling LGMD2R in zebrafish using genome

editing tools

Ecem Kural Mangıt, Gülsüm Kayman Kürekçi, Cansu

Koyunlar, Fulya Yaylacıoğlu Tuncay, Şeyda Ünsal

Hacettepe University Faculty of Medicine Department of

Medical Biology

Objective: Limb girdle muscular dystrophy (LGMD) is a

rare neuromuscular disorder affects mainly proximal

muscles. In 2013 our group has described an ultra-rare

autosomal recessive LGMD phenotype caused by an

unusual desmin mutation (LGMD2R, MIM 615325).

Mutation was found to be located on the lamin B

binding domain of desmin protein. However there is no

intracellular desmin accumulation observed. It has been

predicted that the disease phenotype caused by a

mechanotransduction error due to loss of interaction

between desmin and lamin B proteins. Our aim is to

create a patient-specific model in order to understand

the underlying mechanisms of the disease.

Materials-Methods: Using CRISPR/Cas9, we knocked-out

desmin orthologues (desma and desmb) in zebrafish and

described their differential expression profiles via in-situ

hybridization. Co-immunoprecipitation and in-situ

proximity ligation assays were performed using zebrafish

muscle. We use TALENs to create patient specific

mutation.

Results: The results showed that desma expression is

mainly somitic while desmb expressed in gut. However

desma expression observed in gut in the absence of

desmb. We demostrated that desmin interacts directly

with lamin B in wild-type zebrafish muscle. To mimic the

patient-specific mutation we disrupted the lamin Bbinding

domain on desma by creating an early stop

codon using TALEN.

Conclusion: Since the desmin-lamin B interaction was

hindered in mutant zebrafish, mechanotransduction

cascade is expected to be disrupted. Research on mutant

fish is ongoing. This study is going to reveal new

mechanism for disease formation by demonstrating the

primer pathology in LGMD2R caused by

mechanotransduction error.

Bu proje TÜBİTAK tarafından desteklenmektedir (214S174)

LGMD2R’nin genom düzenleme araçları

kullanılarak zebra balığında modellenmesi

Ecem Kural Mangıt, Gülsüm Kayman Kürekçi, Cansu

Koyunlar, Fulya Yaylacıoğlu Tuncay, Şeyda Ünsal

Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı

Amaç: Limb-Girdle müsküler distrofiler (LGMD)

proksimal kaslarda tutulumla karakterize olan

nöromüsküler nadir hastalık grubudur. Grubumuz

tarafından 2013 yılında desmin geninde ilk kez rastlanan

bir mutasyonun neden olduğu otozomal resesif LGMD

fenotipi tanımlanmıştır (LGMD2R, MIM 615325).

Mutasyonun desmin proteininin lamin B proteini ile

etkileşim bölgesinde olduğu tespit edilmiştir. Ancak

hastalık klasik desminopati fenotipinden farklı olarak

hücre içinde desmin birikimine neden olmamaktadır.

Hastalık fenotipine desminin lamin B ile etkileşiminin

bozulmasından kaynaklanan mekanotransdüksiyon

hatasının neden olduğu düşünülmektedir. Amacımız

hastaya özgül bir model oluşturarak hastalığın

mekanizmasını anlayabilmektir.

Gereç-Yöntem: CRISPR/Cas9 kullanılarak zebra balığında

desma ve desmb olmak üzere iki kopya halinde bulunan

desmin izoformları KO edimiş ve farklı ifade profilleri in

situ-hibridizasyon ile gösterilmiştir. Yabanıl tip zebra

balığı kas dokusu ve doku kesitleri kullanılarak birlikteimmünçöktürme

ve PLA deneyleri yapılmıştır. Hastaya

özgül model oluşturabilmek için TALEN genom

düzenleme aracı kullanılmıştır.

Bulgular: In-situ hibridizasyon çalışmasının sonuçları

desma’nın iskelet kasında ve desmb’nin düz kaslarda

ifade olduğunu göstermiştir. Ancak; desmb’nin KO

olduğu durumlarda desma ifadesi düz kaslarda da

görülmektedir. Birlikte-immünçöktürme ve PLA deneyleri

ile desmin-lamin B proteinlerinin yabanıl tip zebra

balıklarında doğrudan etkileşimde olduğu gösterilmiştir.

TALEN kullanılarak desmin-lamin B bağlanma bölgesi,

desma üzerinde erken stop kodonu oluşturmak suretiyle

bozulmuştur.

Sonuç: Yabanıl tip balıklarda görülen desmin-lamin B

etkileşimi mutant balıklarda olmayacağından erişkin

dönemde mekanotransdüksiyon kaskadının bozulması

beklenmektedir. Çalışmalarımız bu yönde devam

etmektedir. Bu çalışma ile LGMD2R hastalığında kas

dejenerasyonuna neden olan primer patolojinin

mekanotransdüksiyon hasarı olduğu gösterilerek yeni bir

hastalık oluşum mekanizması literatüre kazandırılacaktır.