KONJENİTAL SEPTAL DEFEKTLERİN ONARIMINA YÖNELİK PERİKARD BAZLI REJENERATİF KARDİYAK YAMALARIN DOKU MÜHENDİSLİĞİ YÖNTEMİ İLE GELİŞTİRİLMESİ

Tez Türü: Doktora

Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye

Tez Danışmanı: Kezban Ulubayram

Tezin Onay Tarihi: 2021

Tezin Dili: Türkçe

Desteklendiği Program: Diğer

Özet:

Kardiyak yamalar konjenital kalp hastalıklarının ve miyokardiyal enfarktüs (MI) tedavisinde yaygın olarak kullanılmakla birlikte henüz ideal bir kalp yaması geliştirilmemiştir. Bu tez kapsamında konjenital septal defektler, MI onarımı gibi çeşitli kardiyak doku hasarlarında kullanılmak üzere rejeneratif kardiyak yamaların doku mühendisliği yöntemi ile geliştirilmesi amaçlanmıştır. Bu amaçla tez çalışmasının birinci bölümünde sıçan kemik iliğinden izole edilmiş mezenkimal kök hücreler (rt-MKH) aselüler perikard dokusuna ekilerek 10 µM 5-Azasitidine (5-Aza) maruz bırakılmış ve kalp atımının mekanik ve elektriksel uyarımlarla taklit edildiği biyomimetik biyoreaktör sisteminde kültür edilmiştir. Uygulanan biyofiziksel uyarımların kardiyomiyosit faklılaşması üzerine etkileri incelenmiştir. qPCR analiz sonuçları kök hücrelerin elektromekaniksel uyarımlar altında kardiyak spesifik belirteçlerini (GATA-4, MEF2C, NKX2.5 ve CACNA1C) ifade ettiğini göstermiştir. Elektromekaniksel uyarım uygulanarak geliştirilmiş kardiyak yamaların in vivo etkinlikleri MI modelinde test edilmiştir. İmplantasyondan 21 gün sonra denekler sakrifiye edilerek histolojik analizler yapılmıştır. Sonuçlar, MI modelinin başarılı bir biçimde oluşturulduğunu, yara bölgesinde yama kaynaklı kalsifikasyonunun görülmediğini, elektromekaniksel olarak uyarılmış yamaların kullanıldığı grupta daha fazla hücrelerin yamadan yara bölgesine göç ettiği ve daha düşük düzeyde inflamasyonun geliştiğini göstermiştir. Ayrıca hem yara bölgesinde hem de yara bölgesinden çıkarılan yamada temel kasılma birimi olan sarkomer yapısı ile ilişkili proteinleri (kardiyak troponin T (cTroT), miyozin ağır zinciri (MHC), sarkomerik alfa aktinin (SAC)) ve hücreler arasındaki mekanik bağlantı birimi olan N-kaderini (nCAD)) ifade eden hücrelerin olduğu görülmüştür. Çalışmanın ilk bölümünde umut vaden sonuçlar elde edilmiş olmakla birlikte biyofiziksel uyarımların kök hücrelerin kardiyomiyojenik farklılaşmasında yeterli olmadığı ve yeni stratejilerin geliştirilmesi gerektiği sonucuna varılmıştır.

Bu nedenle tez çalışmasının ikinci bölümünde ise rt-MKH’lerde kimyasal (5-Aza ve dimetilsülfoksit (DMSO)) ve biyolojik stimülatörlerin (TGF-β1, FGF-2 ve BMP-2) birlikte kullanılarak çeşitli farklılaştırma prosedürleri test edilmiştir. 7. günün sonunda 5-Aza (10 µM) ve DMSO’nun (%1) birlikte kullanıldığı grupta yüksek hücre canlılığı ve en yüksek kardiyak spesifik belirteçlerin elde edildiği gözlenmiştir. 5-Aza ve DMSO’ya maruz bırakılan hücrelerin kardiyak spesifik proteinleri (cTroT, SAC, konneksin 43 (Cnx43) ve α-düz kas aktini (α-SMA)) ifade ederek kardiyomiyositlere farklılaştıkları, ancak organize olmayan bir sarkomer yapısı ve protein paterni bakımından fetal dönem kardiyomiyosit yapısı gösterdikleri gözlemlenmiştir. Organize sarkomer yapısı ve yetişkin dönem fonksiyonel kardiyomiyositler elde etmek için insan ve sıçan kaynaklı kemik iliği MKH’leri (h-MKH ve rt-MKH) epigenetik yeniden programlama (asetilasyon aktivasyonu ve metilasyon inhibisyonu) ve biyolojik yolak manipülasyonlarını (WNT ve TGFβ sinyal yolaklarının inhibisyonu) sağlayacak küçük moleküllere (valproik asit (Va), 5-Aza, DMSO, IWP-2 (WNT inhibitörü), repsox (TGFβ inhibitörü)) maruz bırakılmış ve hücre morfolojisi, hücre canlılığı, kardiyak spesifik belirteçlerin gen ve protein düzeyindeki ifadesi incelenmiştir. Sonuçlar, hücre kaynağına ve küçük molekül kombinasyonuna bağlı olarak farklı hücre morfolojisi ve kardiyak spesifik gen ifadesinin elde edildiğini göstermiştir. h-MKH’lerde yüksek hücre canlılığı ile birlikte kardiyomiyosit benzeri homojen bir morfoloji (uzamış iğsi bir görünüm) ve GATA-4, NKX2.5 ve MEF2C ifadelerinde rt-MKH’lerine göre anlamlı düzeyde artış meydana geldiği izlenmiştir. 14 gün sonunda yapılan immünfloresan boyama analiz sonuçları uygulanan farklılaştırma prosedürüne ve hücre kaynağına bağlı olarak protein ifade paterni ve sarkomer organizasyounun değiştiğini göstermiştir. Her iki hücre tipinin uygulanan tüm farklılaştırma prosedürleri ile translasyonel düzeyde kardiyomiyositlere farklılaştığı ancak rt-MKH’lere kıyasla h-MKH’lerin Cnx43, cTroT ve α-SMA ifadesi bakımından yetişkin kardiyomiyositlere daha çok benzediği ve daha organize sarkomer yapısına sahip olduğu görülmüştür.

Sonuç olarak kardiyak doku mühendisliği uygulamalarında çeşitli küçük molekül kombinasyonları kullanılarak MKH’lerin daha yüksek verimle kardiyomiyosit hücrelerine farklılaştırılabildiği gösterilmiştir. Ayrıca yetişkin kardiyomiyositlerin elde edilmesinde h-MKH’lerin daha uygun hücre kaynağı olduğu sonucuna varılmıştır.