Akademik Veri Yönetim Sistemi
Kulaksız Erkmen G. (Yürütücü), Baştuğ T., Cantürk Tan F., Kavaklı İ. H.
TÜBİTAK Projesi, 2022 - 2025
Kanser, yılda 10 milyona yakın kişinin ölümüne neden olan önemli bir hastalık grubudur ve etkin şekilde tedavisi mortalitenin önlenmesinde kritik önem taşır. Malin tümörlerin tedavisinde kemoterapi sıklıkla kullanılır ve kemoterapi protokolleri içinde sisplatini içeren platinli ilaçlar geniş yer tutar.
Sisplatin, uygulanması sonrası hücre içine ulaştığında güçlü elektrofilik yapıdaki aktif formuna döner ve nükleofilik bölgesi olan makromoleküllerle etkileşerek hasar oluşturur. İlacın asıl sitotoksik-antikanser etkisi indüklediği DNA hasarları nedeniyle gerçekleşir. Bu hasarlar hücrenin replikasyon-transkripsiyon süreçlerini engelleyerek kanserli hücreyi apoptoza götürür. Hasarlar DNA onarım mekanizmaları ile etkin şekilde onarılırsa sisplatin sitotoksik etkisini gösteremez ve ilaç direnci gelişir. İlaç direnci ise kanser tedavilerinde en önemli kısıtlayıcı faktörlerdendir. Çeşitli kanser hücrelerinde NER aktivitesinin/NER’de görevli proteinlerin ifadelenmesinin yüksek olduğu, bu yükseklik ile platin tedavisine direnç/yanıt, hastalığın prognozu arasında ilişki olduğu gösterilmiştir.
Sisplatinin oluşturduğu DNA hasarlarının %90’ından fazlası zincir-içi DNA eklentileridir ve büyük olukta distorsiyona neden olurlar. Bu hasarlar helikste bükülme yapan büyük DNA eklentilerini ve zincir-içi bağlar oluşturan hasarların tamirini gerçekleştiren nükleotid eksizyon onarımı(NER) ile tamir edilirler. Mekanizma kısaca şöyledir: DNA hasarı Kseroderma_Pigmentozum(XP)_grup_A(XPA), XPC, replikasyon_proteini_A(RPA) proteinleri tarafından tanınır, Transkripsiyon_faktörü_IIH’nin XPB ve XPD alt üniteleri hasarı içeren ~25 nükleotidlik bölgeyi çözer. XPG hasar bölgesine geldiğinde XPC bölgeden ayrılır. XPF-eksizyon_onarım_kros-komplemantasyon_grup_1(ERCC1)’in bölgeye gelmesiyle XPG hasarın 3’ yönünde, XPF-ERCC1 de 5’ yönünde ikili kesim yapar. Böylelikle DNA hasarını içeren 24-32 nükleotidlik oligonükleotid parça iki yönlü olarak kesilip-çıkarılır(eksizyon). Kesip-çıkarma sonrası kalan boşlukta yeni DNA’nın sentezi DNA polimerazlar ile gerçekleştirilir, DNA ligazlar ile zincirin bütünlüğü sağlanır.
İnsan NER’indeki ana proteinlerden XPA, DNA hasarının tanınmasında hasarlı DNA’ya bağlanır, ERCC1’i hasar bölgesine çağırır ve etkileşime girer, oligonükleotid parçanın 5’ yönünde kesilmesinde kritik olan XPF-ERCC1 heterodimerinin oluşumuna aracılık eder. ERCC1 farklı onarım süreçlerinde de görev alır. XPA ve ERCC1 platin grubu kemoterapötiklerin, radyoterapinin oluşturduğu hasarların tamirinde gereklidir ve ifadelenme düzeylerinin yüksek olmasının tedaviye direnç gelişiminde rol oynadığı gösterilmiştir.
ERCC1’in NER’de işlevini gösterebilmesi için XPA tarafından hasar bölgesine çağrılması ve onunla etkileşimi gereklidir. Bu etkileşimin yalnızca NER aracılı DNA onarım mekanizması için gerekli olduğu bilinmektedir. Yapılan çalışmalarda XPA-ERCC1 etkileşiminin engellenmesi durumunda NER’e bağlı DNA onarımının gerçekleşmediği gösterilmiştir. Bu bulgulardan yola çıkılarak kısıtlı sayıda yapılan çalışmalarda XPA-ERCC1 etkileşimini engelleyen küçük moleküller tasarlanmış fakat etkinlikleri ılımlı bulunmuştur. Bu çalışmalar her iki proteinin etkileşimini engelleyen güçlü moleküllerin yapıya dayalı ilaç geliştirme yöntemleri ile bulunması hipotezini desteklemektedir. DNA onarımını engelleyecek moleküllerin sisplatin tarafından indüklenen hasarların onarımını engelleyeceği, böylece ilaç direncini azaltarak tedavi etkinliğini arttırabileceği düşünülmektedir.
Bu proje önerisi, ERCC1’in XPA ile etkileşim gösteren bölgesinin moleküler dinamik yöntemi ile moleküler yanaştırma çalışmalarının yapılmasını amaçlamaktadır. Sonrasında toplamda 8 milyon küçük molekül sanal ortamda taranarak ERCC1’in XPA ile etkileştiği bölgeye yönelik bağlanma enerjileri en iyi (<-7 kcal/mol bağlanma enerjisine sahip moleküller) 100 molekül belirlenecektir. Belirlenen moleküller ile in vitro çalışmalar yapılarak ERRC1’in XPA proteini ile etkileşimini engellediği ve buna bağlı olarak NER mekanizmasının inhibe edildiği in vitro çalışmaların proje kapsamında yapılması amaçlanmıştır. Uygun moleküllerin sentezlenmesi, hücre üzerinde sitotoksik etkilerinin belirlenmesi, XPA-ERCC1 etkileşimi üzerine etkilerinin biyokimyasal ve in vivo olarak hücre hatlarında araştırılması planlanmaktadır. Bu moleküller insan melanoma(A375) hücrelerine uygulanacak, farklı derişimlerde hücre canlılığına etkileri MTT yöntemi ile test edilecektir. Hücre üzerinde toksik etkili olan moleküller elenecek, en etkili 20 molekülün XPA-ERCC1 etkileşimini bozucu etkileri ERCC1 ile immün çöktürme ve western blotlama ile araştırılacaktır. En etkin 5 molekülün NER üzerine etkileri UV-C duyarlılığını arttırma potansiyelleri MTT ve immünoslot-blot yöntemi kullanılarak değerlendirilecektir.
Çalışma sonuçlarının temel ve klinik anlamda literatüre katkısı olacağı öngörülmektedir. Sisplatin direncinin azaltılmasının kanser hastalarında daha düşük doz sisplatin kullanımı ve düşük yan etkilerle etkin tedavinin gerçekleşmesini sağlayacağı, halk sağlığı açısından faydası olacağı öngörülmektedir. Aday ilaçların belirlenmesi ileriki çalışmalara veri sağlayacaktır. Daha önce Kuzey_Karolayna_Üniversitesi’nde Prof.Dr.Aziz_Sancar’ın laboratuvarında öğrenilmiş/uygulanmış NER’i ölçen immünoslotblot yönteminin ülkemizde uygulanması ve bursiyerlere öğretilmesi projenin bir diğer yaygın etkisi olacaktır.