Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinde PKNOX2 Proteinin ATM ve RNF8 ile Etkileşimlerinin İncelenmesi
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Kök Hücre Bilimleri A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2019
Tezin Dili: Türkçe
Öğrenci: NESLİHAN DÖNMEZ
Danışman: Ayşen Özcan
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Son araştırmalar transkripsiyon faktörü PKNOX2'nin tümör baskılayıcı bir protein olduğunu ve Fanconi anemisi hastalarının kemik iliği kaynaklı mezenkimal kök hücrelerinde (Kİ-MKH'lerinde) azaldığını göstermiştir. Günel-Özcan grubunun yayınlanmamış çalışmasında PKNOX2 ko-immunopresipitasyon sonrası proteom analiz listesinde PKNOX2'nin etkileştiği proteinler arasında ATM ve RNF8 proteinlerinin düşük 'coverage' değeri ile saptanmış olması PKNOX2'nin DNA onarım yolağında rol oynayabileceğini düşündürmüştür. Bu çalışmanın amacı bu hipotezi test etmek için, PKNOX2 proteini ile ATM ve RNF8 proteinlerinin etkileşimini doğrulamak ve bu etkileşimin DNA hasarı ile durumunu Kİ-MKH'lerinde araştırmaktı. Etkileşimlerin doğrulanması için Kİ-MKH'lerine PKNOX2 overekspresyon plazmidi elektroporasyon ile aktarıldı ve protein izolasyonu sonrası, ko-immunopresipitasyon ve Western blotlama yapıldı. Ko-IP sonrası Western Blot analizleriyle PKNOX2 ile ATM etkileşimi doğrulanırken, IgG heavy chain kirliliği olabileceği değerlendirmesi PKNOX2 ile ATM veya RNF8 etkileşiminin varlığı in situ proximity ligation assay (PLA) ile gerçekleştirilmiştir. PLA yöntemiyle bu etkileşimlerin hem sitoplazma hem çekirdek içinde olduğu saptanmıştır. DNA hasarı durumunda etkileşimleri incelemek için ɣ-irradiye edilen Kİ-MKH'lerde DNA hasarı oluştuğu akım sitometri yöntemiyle doğrulanmıştır. PI boyaması ile yapılan akım sitometri analizlerinde hücre döngüsü piklerinde keskin ayrışma olmadığından kesin sonuca varılamamakla birlikte DNA hasarına uğrayan hücrelerin G2 fazında tutuklandığı bulunmuştur. ɣ-irradyasyon ile DNA hasarına uğrayan hücrelerde PLA, PKNOX2 ile ATM etkileşimini gösterememiştir ancak PKNOX2-RNF8 etkileşimi artmıştır. Sonuç olarak PKNOX2 transkripsiyon faktörünün ATM ve RNF8 ile etkileştiği literatürde ilk kez olarak gösterildi. DNA hasarı ile etkileşimlerdeki değişim daha ileri çalışmalar ile doğrulanmalıdır.