Development of bacteriophage nanoparticles for glycomics analysis by genetic engineering
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2014
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: GÖKSU GÜR
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): EDA ÇELİK AKDUR
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Kompleks karbonhidratlar (glikanlar) glikozilasyon prosesi sonucunda lipid ve proteinlere bağlanırlar ve hücre-hücre tanıması, metabolik alışveriş, patojen-konakçı ilişkisi de dahil olmak üzere birçok biyolojik süreçte önemli roller oynarlar. Değişim geçiren glikozilasyonun, kanser ve retroviral enfeksiyonlar gibi hastalıkların nedeni olduğu bilinmektedir. Karbonhidrat tabanlı dizinler (arrays), ya da "glikodizinler," glikomiks çalışmalarında güçlü bir araç olarak son on yılda ortaya çıkmıştır. Ancak bu dizinlerin potansiyelini arttırmak için, glikanların çeşitliliğini arttırmak ve katı destek üzerine karbonhidrat problarının immobilizasyonunu güvenilir ve tekrarlanabilir olacak şekilde geliştirmek gerekli olacaktır. Yakın zamanda, Campylobacter jejuni bakterisinde keşfedilen protein glikozilasyon gen bölgesi (Pgl), Escherichia coli bakterisine aktarılarak, bu bakteriye proteinleri glikozilleme yeteneği kazandırmıştır. Ayrıca, araştırma grubumuz, glikozilasyon genini taşıyan E. coli'yi enfekte eden, ve bir "alıcı proteini" taşıyan M13 bakteriyofaj parçacıklarının N-glikozillenebildiğini göstermiştir. Faj desenli mikrodizinlerin proteomik çalışmalarında artık kabul görmüş bir metod olduğu göz önüne alındığında, gelecekte GlikoFaj parçacıklarının mikrodizin kütüphanelerine eklenerek patojenlerin ve kanser teşhisinde kullanılması mümkün olacaktır. Bu çalışmada, konak hücre mühendisliği ve altı yeni bisistronik fajmid tasarımı ve üretimi planlanmış (pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBPDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xAQNAT-g3p::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3p::PglBmut, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglB, pBAD-MBP4xDQNAT-g3ptr::PglBmut) ve tasarlanan fajmidlerin üretimi standart genetik mühendisliği teknikleri ile gerçekleştirilmiştir. Üretilen fajmidlerin restriksiyon enzimleri ile kesildikten sonra jel elektroforezinde boyut kontrolü ve ayrıca DNA dizin analizi ile doğrulaması yapılmıştır. Hücre içi glikan havuzunun arttırılarak faj parçacıklarının glikozillenme potensiyelinin arttırılması için, E. coli TG1 konak hücresinde bulunan waaL geninin silinmesi flüoresan aktif hücre ayırma (FACS) analizi ile doğrulanmıştır. Ardından glikofaj üretim kapasitesi ve faj stabilitesini arttırabilmek için farklı parametreler test edilmiş; (i) fajmidde kodlanan kısaltılmış-g3p, normal-g3p ile kıyaslandığında, glikanların faj üzerindeki gösteriminin daha etkin ve stabil olduğu saptanmış; (ii) daha spesifik sinyaller alabilmek için farklı saflaştırma koşulları araştırılarak, sarkosyl ile muamele edilen örneklerden daha yüksek anti-glikan sinyali alındığı görülmüş; (iii) indükleme koşullarının hücre çoğalması ve faj üretimindeki etkisini kıyaslamak için dokuz farklı parametre sınanmış; OD600=0.6 hücre derişiminde, 8x109 cfu/mL hacminde yardımcı faj ile enfekte edilen hücrelerden ve 16 saatlik indükleme sonrasında en yüksek glikofaj derişimi elde edilmiştir. Son olarak glikomik analizlemede yeni bir yöntem olan "glikofaj-ELISA metodu" ilk kez geliştirilmiştir. Dolaylı-ELISA metodu en uygun ELISA çeşidi seçilmiş; sınanan farklı bloklama tamponlarından %2 BSA-PBS (bovin serum albümin) tamponu ile anti-glikan antikoru ile daha spesifik bir sinyal elde edilmiştir. Bu çalışma, karbonhidrat temelli olmayan, basitleştirilmiş ve evrensel bir glikan saflaştırma tekniği sunması; nispeten daha ekonomik ve kararlı bir glikan temsil metodu olması sebepleriyle önem taşımaktadır. Farklı glikozilasyon yolaklarını kodlayan yeni plazmidlerin geliştirilmesiyle, glikofajların çeşitliliği gelecekte arttırılabilir. Sonuç olarak, bu çalışmada tanımlanan "glikofaj dizin teknolojisi", glikan kütüphanelerinin genişletilmesine fayda sağlayacağı gibi, glikan-protein etkileşimlerinin yüksek-verimli analizinde kullanılan ekipmanların geliştirilmesinde tamamlayıcı bir özellik gösterecektir.