Novel cellulase enzyme production towards biofuels sector by recombinant bacterium Escherichia coli
Tezin Türü: Yüksek Lisans
Tezin Yürütüldüğü Kurum: Hacettepe Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü, Biyomühendislik A.B.D., Türkiye
Tezin Onay Tarihi: 2015
Tezin Dili: İngilizce
Öğrenci: ZEHRA YILDIRIM
Asıl Danışman (Eş Danışmanlı Tezler İçin): EDA ÇELİK AKDUR
Açık Arşiv Koleksiyonu: AVESİS Açık Erişim Koleksiyonu
Özet:Yenilenebilir bir enerji kaynağı olan biyoetanolün üretim prosesinde yer alan selülaz enzimlerinin, pH-stabil, termo-stabil ve ekonomik olması, ticari verimlilik açısından önem teşkil etmektedir. Mısır ve şeker kamışı gibi gıda hammaddeleri yerine selülozik biyokütleden biyoetanol eldesinde kullanılan endoglukanaz tipi selülazların üretim maliyetlerinin düşürülmesine yönelik geliştirilen proseste, konakçı hücrenin seçimi son derece önemlidir. E. coli bakterisi, rekombinant protein üretiminde en çok tercih edilen mikroorganizmaların başında gelmektedir ve glikozilasyon mekanizmalarının bakterilerde varlığı yakın zamanda keşfedilmiş, Campylobacter jejuni bakterisinde bulunan basit bir protein glikozilasyon gen bölgesi (pgl), E. coli bakterisine aktarılarak, endüstriyel önem teşkil eden bu bakteriye proteinleri glikozilleme yeteneği kazandırmıştır. Çalışmamızda, pET28a-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, pET28a-ssYebF-Cel5A-6xHis, pTrc99A-ssDsbA-Cel5A-Flag-6xHis, ve pTrc99A-ssYebF-Cel5A-6xHis plazmidleri tasarlanmış ve bu yeni plazmidlerin yanı sıra, pMAF_pglB ve/veya pPglΔB plazmidlerini de içeren onaltı yeni sistem geliştirilmiştir. Tasarlanan plazmidler standart genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak sentezlendikten sonra restriksiyon analizi ve DNA dizi analizi yönlemleri ile doğrulanmıştır. Doğal ve glikozillenmiş selülaz enzimleri (Cel5A) SDS-PAGE ve Western Blot analizleri ile doğrulanmıştır. Daha sonra selülaz üretiminin arttırılması amacıyla, (i) besi ortamı (ii) indükleyici konsantrasyonları, (iii) karbon kaynağı, (iv) ODind (v) indükleme sonrası ortam sıcaklığı, (vi) örnekleme zamanı, (vii) hücre parçalama koşulları gibi biyoproses koşulları optimize edilmiş ve DNS aktivite metodu modifiye edilmiştir. Biyoproses tam olarak geliştirilmiş ve sonuç olarak üretilen dört farklı selülazın aktiviteleri; hücre-içi doğal tip 21-kat (0.219 IU/mL'e); hücre-dışı doğal tip, 1.8-kat (0.302 IU/mL'e); glikozillenmiş hücre-içi tip, 68-kat (1.02 IU/mL'e); hücre-dışı doğal tip 3-kat (0.782 IU/mL'e) arttırılmıştır ve bu değer yakın zamanda rapor edilen glikozillenmemiş selülaza göre 6-kat daha yüksektir. Glikozillenmiş ve glikozillenmemiş enzimlerin her ikisi için de enzim kinetiği çalışmalarında yaklaşık aynı Km değeri elde edilmiş (3.2 mM), glikozilasyonun enzim aktif bölgesini etkilemediği düşünülmüştür. Rekombinant selülaz enzimi, biyoyakıtlar ve enerji sektöründeki darboğazı gidermesi açısından son derece önemlidir ve bu çalışma, daha da geliştirildiği takdirde, ticari ölçekli biyoetanol üretim prosesinde kritik öneme sahip olan selülaz enziminin üretim maliyetini düşürme potansiyeline sahiptir. Anahtar Kelimeler: Biyoyakıt, Selülaz, Rekombinant E. coli, Glikolizasyon, Glikoprotein